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Dec 07, 2023

ex vivo で心臓生理学および病態生理学をエミュレートする生体模倣心臓組織培養モデル (CTCM)

Edizione di biologia della comunicazione

Communications Biology volume 5、記事番号: 934 (2022) この記事を引用

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薬物検査のために心臓の生理学的環境を正確に再現できる、信頼性の高い in vitro システムが必要です。 ヒト心臓組織培養システムの入手可能性が限られているため、心臓関連の薬の効果が不正確に解釈されています。 今回我々は、心臓周期中の収縮期と拡張期の生理学的ストレッチで心臓スライスを電気機械的に刺激できる心臓組織培養モデル（CTCM）を開発しました。 12 日間培養した後、このアプローチにより心臓切片の生存率は部分的に改善されましたが、構造的完全性は完全には維持されませんでした。 したがって、小分子スクリーニングの後、100 nM トリヨードチロニン (T3) と 1 μM デキサメタゾン (Dex) を培地に組み込むと、切片の顕微鏡構造が 12 日間保存されることがわかりました。 T3/Dex 治療と組み合わせると、CTCM システムは転写プロファイル、生存率、代謝活性、および構造的完全性を 12 日間新鮮な心臓組織と同じレベルに維持しました。 さらに、心臓組織の過剰な伸長は、培養中の心臓肥大シグナル伝達を誘導し、これは、心臓の伸長によって誘発される肥大状態をエミュレートするCTCMの能力の概念実証を提供する。 結論として、CTCM は培養中の心臓生理学と病態生理学を長期間エミュレートすることができ、それによって信頼性の高い薬物スクリーニングが可能になります。

臨床研究の前に、人間の心臓の生理学的環境を正確に再現できる信頼性の高い in vitro システムが必要です。 このようなシステムでは、機械的ストレッチ、心拍数、電気生理学的特性の変化をモデル化する必要があります。 心臓生理学スクリーニングのプラットフォームとして広く使用されている動物モデルは、人間の心臓で見られる薬物の影響を反映する信頼性が限られています 1,2。 最終的に、理想的な実験用心臓組織培養モデル (CTCM) は、人間の心臓の生理機能と病態生理学を正確に再現しながら、さまざまな治療的介入や薬理学的介入に対して高い感度と特異性を示すものです 3。 このようなシステムの欠如により、新しい心不全治療薬の創薬は制限されており 4,5 、その結果、薬物誘発性心毒性が市場撤退の主な原因となっています 6。

過去 10 年間で、8 種類の非心臓血管薬が QT 間隔の延長を誘発し、心室性不整脈や突然死を引き起こすため、臨床使用から撤退しました7。 したがって、心血管の有効性と毒性を評価するための信頼できる前臨床スクリーニング戦略の必要性が高まっています。 最近、薬物スクリーニングおよび毒性試験におけるヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞 (hiPS-CM) の使用への移行により、この問題に対する部分的な解決策が提供されました。 しかし、hiPS-CM の未熟な性質と心臓組織の多細胞の複雑さの欠如が、この技術の大きな限界となっています 8。 最近の研究では、自発収縮の開始直後の初期段階の hiPS-CM を使用して心臓組織ヒドロゲルを形成し、時間の経過とともに徐々に増加する電気刺激にさらせば、この制限を部分的に克服できることが示されています9。 しかし、これらの hiPS-CM 微小組織には、成人の心筋の成熟した電気生理学的特性と収縮特性が欠けています。 さらに、ヒトの心臓組織は構造的により複雑で、特定の細胞外マトリックスタンパク質で結合された内皮細胞、ニューロン、間質線維芽細胞などのさまざまな細胞種の不均一な混合物で構成されています10。 成体哺乳動物の心臓における非心筋細胞集団のこの不均一性 11、12、13 は、個々の細胞タイプを使用して心臓組織をモデル化する際の大きな障害となっています。 これらの大きな制限は、生理学的および病理学的条件下で無傷の心筋組織を培養する方法を開発することの重要性を強調しています9。

培養された薄い (300 μm) ヒト心臓スライスは、無傷のヒト心筋の有望なモデルであることが証明されています。 この技術は、人間の心臓組織に似た完全な三次元多細胞システムへのアクセスを提供します。 しかし、2019 年以前は、培養心臓スライスの使用は、培養中の生存期間が短い (24 時間) ため制限されていました 14、15、16。 これは、生理学的機械的ストレッチの欠如、気液界面、心臓組織の要求をサポートしない単純な培地の使用など、複数の要因によるものです。 2019年、いくつかのグループが、心臓組織培養システムに機械的因子を組み込むことで、培養寿命を延長し、心臓の発現を改善し、心臓病理のモデルを作成できることを実証した。 2 つの優れた研究 17 および 18 では、培養中の心臓の表現型に対する一軸性の機械的負荷のプラスの影響が示されています。 しかし、これらの研究では、心臓スライスには等尺性伸張力 17 または線形自己緊張性負荷 18 のいずれかが負荷されていたため、心周期の動的三次元生理学的機械負荷は使用されませんでした。 組織を引き伸ばすこれらの方法は、複数の心臓遺伝子の下方制御、または病理学的伸縮反応に関連する遺伝子の過剰発現をもたらしました。 特に、Pitoulis ら 19 は、力変換器フィードバックとストレッチャー アクチュエーターを使用して心臓周期を再現するための動的心臓スライス培養槽を開発しました。 このシステムにより、心周期を in vitro でより正確にシミュレートできるようになりましたが、この方法の複雑さとスループットの低さにより、システムの応用が制限されました。 私たちの研究室は最近、ブタとヒトの心臓組織切片を最長 6 日間生存可能な状態に保つために、電気刺激と最適化された培地を使用した簡素化された培養システムを開発しました 20,21。

現在の原稿では、ブタ心臓スライスを使用して、体液性合図と組み合わせた心臓周期中の 3 次元の心臓の生理学的および病態生理学的ストレッチを再現する心臓組織培養モデル (CTCM) について説明します。 この CTCM は、前臨床薬物検査向けに哺乳動物の心臓の生理学的/病態生理学的なストレッチを模倣した中スループットでコスト効率の高い心臓システムを提供することにより、前臨床薬物予測の精度をこれまで達成できなかったレベルにまで高める可能性があります。

血行力学的な機械的合図は、インビトロでの心筋細胞の機能の保存において重要な役割を果たします22、23、24。 現在の原稿では、生理学的周波数（1.2 Hz、毎分72拍）で電気的および機械的刺激を同時に誘発することで成人の心臓環境をエミュレートできるCTCM（図1a）を開発しました。 拡張期中に組織が過度に伸びるのを避けるために、三次元印刷装置を使用して組織を 25% 大きくしました (図 1b)。 C-PACE システムによって誘発される電気刺激は、データ収集システムを使用して収縮期の 100 ミリ秒前に開始されるように同期され、心周期を完全に再現しました。 組織培養システムは、プログラム可能な空気圧ドライバー (LB Engineering、ドイツ) を使用して、柔軟なシリコーン膜を周期的に膨張させ、上部のチャンバー内の心臓スライスの伸長を誘導します。 このシステムは、圧力プローブを使用して外部の空気ラインに接続されており、圧力の微調整 (±1 mmHg) とタイミング (±1 ms) が可能です (図 1c)。

a 組織スライスは、デバイスの培養チャンバー内で青色で示されている直径 7 mm のサポート リングに取り付けられています。 培養チャンバーは、薄くて柔軟なシリコン膜によって空気チャンバーから分離されていました。 各チャンバー間には、漏れを防ぐためにシールガスケットが配置されました。 デバイスのカバーには、電気刺激を提供するグラファイト電極が含まれています。 b 組織オーバーサイジング装置、リング ガイド、およびサポート リングの概略図。 組織スライス (茶色) がオーバーサイジング デバイス上に配置され、リング ガイドが装置の外縁の溝に配置されます。 ガイドを使用して、ヒストアクリル接着剤でコーティングされたサポート リングを心臓組織スライス上に注意深く配置します。 c プログラム可能な空気圧ドライバー (PPD) によって制御される空気室内の圧力に関連した電気刺激のタイミングを示す図。 データ収集デバイスを使用して、圧力プローブ センサーを使用して電気刺激を同期させました。 培養チャンバー内の圧力が指定された閾値に達すると、電気刺激を誘発するためにインパルス信号が C-PACE-EM デバイスに送信されます。 d インキュベーターの棚に設置された 4 台の CTCM デバイスの画像。 これら 4 つのデバイスは航空会社によって 1 つの PPD に接続され、圧力センサーが止血弁に挿入されて航空会社内の圧力を監視します。 各デバイスは 6 枚の組織スライスを収容できます。

1 つの空気圧ドライバーを使用して、それぞれ 6 つの組織スライスを収容する 4 つの CTCM デバイスを操作できます (図 1d)。 CTCM内では、空気室の空気圧が流体室の同期した圧力に変換され、心臓スライスの生理学的伸縮が生じます（図2aおよび補足ムービー1）。 80 mmHg での組織の伸びを評価すると、組織スライスの 25% の伸びが得られました (図 2b)。 この伸び率は、心臓切片の正常な収縮性における生理学的サルコメアの長さ 2.2 ～ 2.3 μm に相当することが示されています 17、19、25。 組織の動きは、カスタムカメラセットアップを使用して評価されます（補足図1）。 組織運動の振幅と速度（図 2c、d）は、心周期中の伸長と収縮期および拡張期のタイミング（図 2b）と一致しています。 心臓組織の収縮および弛緩時の伸張および速度は、培養中の12日間にわたって一貫したままでした（図2e）。 培養中の収縮性に対する電気刺激の影響を評価するために、Shape from Shading アルゴリズム (補足図 2a、b) を使用して生きたひずみを決定する方法を開発し、電気刺激のあるひずみとないひずみを区別することができました。同じ心臓スライス（図2f）。 電気刺激のある歪みは、スライスの可動領域内で電気刺激がない場合よりも 20% 高く (R6 ～ 9)、これは収縮機能に対する電気刺激の寄与を示しています。

空気室の圧力、流体室の圧力、および組織の動きの測定の代表的なトレースにより、空気室の圧力が流体室の圧力を変化させ、対応する組織スライスの動きが誘発されることが確認されました。 b 組織スライスの伸び率 (青) の代表的なトレースは、伸び率 (オレンジ色) に対応します。 c 測定された心臓スライスの動きは、測定された動き速度と一致していました。 (d) 心臓スライス サイクルの動き (青線) と速度 (オレンジ色の点線) の代表的なトレース。 e サイクル時間（異なるブタからの n = 19 スライス/グループ）、収縮時間（n = 19 スライス/グループ）、弛緩時間（異なるブタからの n = 19 スライス/グループ）、組織の動き（n = 25 スライス）の定量化異なるブタからの/グループ）、ピーク収縮速度（異なるブタからのn = 24（D0）、25（D12）スライス/グループ）。 ピーク弛緩速度 (異なるブタからの n = 24 (D0)、25 (D12) スライス/グループ)。 両側スチューデント t 検定では、どのパラメーターにも有意な差はありませんでした。 f 同じスライスからの組織スライスの 10 個の領域にわたる電気刺激あり (赤) となし (青) の組織スライスのひずみ解析の代表的なトレース。 下のパネルは、異なるスライスからの 10 個の領域にわたる電気刺激ありとなしの組織スライスのひずみのパーセンテージ差の定量化を示しています。 (異なるブタからの n = 8 スライス/グループ、両側スチューデント t 検定を実行します; ****p < 0.0001、**p < 0.01、*p < 0.05)。 エラーバーは平均値 ± SD を表します。

私たちの以前の静的生体模倣心臓スライス培養システム 20,21 では、電気刺激の適用と培養培地の組成の最適化により、心臓スライスの生存率、機能性、構造的完全性を 6 日間維持しました。 しかし、10 日後、これらのパラメータは急激に減少しました。 以前の静的生体模倣培養システム20,21で培養したスライスを対照条件（Ctrl）と呼び、以前に最適化した培地を使用して同期機械的電気刺激（CTCM）下で培養したスライスをMC条件と呼びます。 まず、電気刺激を伴わない機械的刺激では組織の生存率を6日間維持するには不十分であると判断しました（補足図3a、b）。 興味深いことに、MTT アッセイで示されているように、CTCM を使用して生理学的機械的刺激と電気的刺激の両方を導入することにより、12 日間の心臓スライスの生存率は MC 条件では新鮮な心臓スライスと同様に維持されましたが、Ctrl 条件では維持されませんでした (図3a)。 これは、機械的刺激と心周期のシミュレーションにより、以前の静置培養システムで報告されている時間の 2 倍の時間、組織切片の生存率を維持できることを示しています。 しかし、心臓トロポニン-Tおよびコネキシン43の免疫標識による組織切片の構造的完全性の評価により、12日目のMC組織のコネキシン43発現が同日の対照よりも有意に高いことが実証された。 それでも、コネキシン43の均一な発現とZディスク形成は完全には維持されませんでした（図3b）。 私たちは、人工知能 (AI) ベースのフレームワークを使用して組織の構造的完全性を定量化しました26。これは、局在化の観点からトロポニン T およびコネキシン 43 染色に基づいて心臓スライスの構造的完全性を自動定量化するための画像ベースの深層学習パイプラインに基づいています。そして蛍光強度。 この技術は、畳み込みニューラル ネットワーク (CNN) と深層学習フレームワークを使用して、自動かつ公平な方法で心臓組織の構造的完全性を確実に定量化します。 ＭＣ組織は、静的対照スライスと比較して、０日目との改善された構造的類似性を示した。 さらに、マッソントリクローム染色は、培養12日目の対照条件と比較して、MC条件では線維症の面積パーセントが有意に低いことを示しました（図3c）。 CTCM は、12 日目の心臓組織スライスの生存率を新鮮な心臓組織と同様のレベルまで改善しましたが、心臓スライスの構造的完全性を大幅に改善することはありませんでした。

棒グラフは、新鮮な心臓スライス (D0) または静置培養 (D12 Ctrl) または CTCM (D12 MC) で 12 日間培養した心臓スライスの MTT 生存率の定量化を示します (n = 18 (D0)、15 (D12 Ctrl) )、異なるブタからの 12 (D12 MC) スライス/グループ、一元配置 ANOVA 検定を実行; D0 と比較して ####p < 0.0001、および D12 Ctrl と比較して **p < 0.01)。 b 新たに単離された心臓スライス（D0）、または静的条件（Ctrl）またはCTCM条件（MC）下で12日間培養された心臓スライスのトロポニン-T（緑色）、コネキシン43（赤色）、およびDAPI（青色）の代表的な免疫蛍光画像(裸のスケール = 100 μm)。 人工知能による心臓組織の構造的完全性の定量化 (n = 7 (D0)、7 (D12 Ctrl)、5 (D12 MC) スライス/グループ、それぞれ異なるブタから、一元配置 ANOVA 検定を実行; ####p < D0 と比較して 0.0001、D12 Ctrl と比較して ****p < 0.0001)。 c マッソントリクローム染色で染色された心臓スライスの代表的な画像（左）と定量化（右）（スケールベア = 500 μm）（異なるブタからそれぞれ n = 10 スライス/グループ、一元配置 ANOVA 検定を実行します。#### D0 と比較して p < 0.0001、D12 Ctrl と比較して ***p < 0.001)。 エラーバーは平均値 ± SD を表します。

我々は、小分子を培地に組み込むことによって心筋細胞の完全性が改善され、CTCM 培養中の線維症の発生が軽減される可能性があると仮説を立てました。 したがって、関連する交絡因子の数が少ないため、静的対照培養物 20,21 を使用して小分子スクリーニングを実行しました。 このスクリーニングには、デキサメタゾン (Dex)、トリヨードチロニン (T3)、および SB431542 (SB) が選択されました。 これらの小分子は、サルコメアの長さ、T 細管、および伝導速度を改善することによって心筋細胞の成熟を誘導するために、hiPSC-CM 培養で以前に使用されてきました 27,28。 さらに、糖質コルチコイドである Dex と SB は両方とも炎症を抑制することが知られています 29,30。 したがって、これらの小分子の 1 つまたは組み合わせを組み込むことで心臓スライスの構造的完全性が向上するかどうかをテストしました。 最初のスクリーニングでは、各化合物の用量は、細胞培養モデルで通常使用される濃度 (1 μM Dex27、100 nM T327、および 2.5 μM SB31) に基づいて選択されました。 12日間の培養後、T3とDexの組み合わせにより、心筋細胞の構造的完全性が最も良く、線維性リモデリングが最も低くなりました（補足図4および5）。 さらに、これらの濃度の T3 および Dex の半分または 2 倍を使用すると、通常の濃度と比較して有害な影響がありました（補足図 6a、b）。

最初のスクリーニングに続いて、4 つの培養条件の直接比較を実行しました (図 4a)。 Ctrl: 最適化された培地を使用して前述の静的培養で培養した心臓スライス;20,21 TD: T3 および Dex を培地に添加した Ctrl。 MC: 以前に最適化された培地を使用して CTCM で培養された心臓スライス。 MT: T3 と Dex を培地に添加した CTCM。 培養12日後、MTTアッセイで評価したところ、MCおよびMT組織の生存率は新鮮な組織と同様に維持されました（図4b）。 興味深いことに、トランスウェル培養物 (TD) への T3 および Dex の添加は、Ctrl 条件と比較して生存率を大幅に向上させず、心臓切片の生存率の維持における機械的刺激の重要な役割を示唆しています。

a 12日間にわたる培地への機械的刺激とT3/Dex添加の組み合わせの効果を評価するために使用した4つの培養条件を示す実験計画の概略図。 b 棒グラフは、新鮮な心臓切片（D0）と比較した、4つの培養条件（Ctrl、TD、MC、およびMT）すべてでの培養後12日目の生存率の定量化を示しています（n = 18（D0）、15（D12 Ctrl、D12 TDおよびD12 MT)、異なるブタからの 12 (D12 MC) スライス/グループ、一元配置 ANOVA 検定を実行; ####p < 0.0001、D0 と比較して ###p < 0.001、D12 と比較して **p < 0.01 Ctrl))。 c 棒グラフは、新鮮な心臓スライス (D0) と比較した、4 つの培養条件すべて (Ctrl、TD、MC、および MT) における培養後 12 日目のグルコース フラックスの定量化を示します (異なるブタからの n = 6 スライス/グループ、一方向) ANOVA 検定を実行します; D0 と比較して ###p < 0.001、D12 Ctrl と比較して ***p < 0.001)。 d 組織スライスの10の領域点にわたる新鮮（青）、12日目MC（緑）、および12日目MT（赤）組織のひずみ分析プロット（n = 4スライス/グループ、一元配置ANOVAテストが実行されます。グループ間に有意差はありません）。 e 静的条件（Ctrl）またはMT条件（MT）で10〜12日間培養した心臓切片と比較して、新鮮な心臓切片（D0）で差次的に発現された遺伝子を示す火山プロット。 f 各培養条件下で培養された心臓切片の筋節遺伝子のヒートマップ。 エラーバーは平均値 ± SD を表します。

脂肪酸酸化から解糖への代謝依存の変化は、心筋細胞の脱分化の特徴です。 未成熟心筋細胞は主にATP産生にグルコースを利用し、クリステがほとんどない未発達のミトコンドリアを持っています5,32。 グルコース利用アッセイは、MCおよびMT条件下で、グルコース利用が0日目の組織と同様であることを実証しました（図4c）。 ただし、Ctrl サンプルでは、​​新鮮な組織と比較してグルコース利用の大幅な増加が示されました。 これは、CTCM と T3/Dex を組み合わせると組織の生存率が向上し、12 日間培養された心臓切片の代謝表現型が保存されることを示しています。 さらに、ひずみ分析により、12日間の新鮮な心臓組織と同様のMTおよびMC状態のひずみレベルが維持されることが示されました（図4d）。

心臓スライス組織の全体的な転写状況に対するCTCMおよびT3 / Dexの全体的な影響を分析するために、4つの異なる培養条件すべてからの心臓スライスに対してRNAseqを実行しました（補足データ1）。 興味深いことに、MT スライスは新鮮な心臓組織と高い転写類似性を示し、13,642 個の遺伝子のうち 16 個のみが差次的に発現していました。 ただし、以前に実証したように21、Ctrlスライスは、培養10〜12日後に1,229個の差次的に発現された遺伝子を示しました（図4e）。 これらのデータは、心臓遺伝子および線維芽細胞遺伝子の qRT-PCR によって検証されました（補足図 7a-c）。 興味深いことに、Ctrl スライスでは、心臓遺伝子および細胞周期遺伝子の下方制御と、炎症遺伝子プログラムの上方制御が示されました。 これらのデータは、長期培養後に通常起こる脱分化がMT条件下では完全に弱まったことを示しています（補足図8a、b）。 サルコメア遺伝子を詳しく調べると、MT条件のみが、Ctrl、TD、およびMC条件で見られるダウンレギュレーションから遺伝子をコードするサルコメア（図4f）およびイオンチャネル（補足図9）を保存していることが明らかになりました。 これらのデータは、機械的刺激と体液性刺激 (T3/Dex) の組み合わせにより、心臓切片のトランスクリプトームが培養下で 12 日間新鮮な心臓切片と同様に維持される可能性があることを示しています。

これらの転写所見は、無傷で局在化したギャップ結合タンパク質であるコネキシン43によって示されるように、心臓切片における心筋細胞の構造的完全性がMT状態で12日間最もよく保存されたという事実によって確認されました（図5a）。 さらに、MT状態の心臓切片の線維化は、Ctrlと比較して大幅に減少し、新鮮な心臓切片と同様でした（図5b）。 これらのデータは、機械的刺激と T3/Dex 治療の組み合わせにより、心臓スライスの心臓構造が培養下で長期間効果的に保存されたことを示しています。

a 新たに単離された心臓スライス（D0）または 4 つの培養条件すべてで 12 日間培養された心臓スライスのトロポニン T（緑）、コネキシン 43（赤）、および DAPI（青）の代表的な免疫蛍光画像（スケールバー = 100 μm） 。 人工知能による心臓組織の構造的完全性の定量化 (n = 7 (D0 および D12 Ctrl)、異なるブタからの 5 (D12 TD、D12 MC および D12 MT) スライス/グループ、一元配置 ANOVA 検定を実行; #### D0 と比較して p < 0.0001、および *p < 0.05、または D12 Ctrl と比較して ****p < 0.0001)。 b マッソントリクローム染色で染色された心臓スライスの代表的な画像と定量化（スケールバー = 500 μm）（n = 10（D0、D12 Ctrl、D12 TD、および D12 MC）、異なるブタからの 9（D12 MT）スライス/グループ、一元配置 ANOVA 検定を実行します; ####p < 0.0001 (D0 と比較して)、***p < 0.001、または ****p < 0.0001 (D12 Ctrl と比較))。 エラーバーは平均値 ± SD を表します。

最後に、心臓組織の伸張振幅を増加させることによって、心臓肥大をモデル化する CTCM の能力を評価しました。 CTCMでは、空気室内のピーク圧力が80 mmHg（通常の伸長）から140 mmHgに増加しました（図6a）。 これは伸張の 32% 増加に相当し (図 6b)、これは心臓スライスが肥大で見られるのと同様のサルコメア長を達成するために必要な適切な伸張パーセントであることが以前に示されています 17,19,25。 心臓組織の収縮および弛緩時の伸張および速度は、6日間の培養期間にわたって一貫したままでした（図6c）。 MT 条件からの心臓スライス組織は、通常の伸長条件 (MT (Norm)) または過剰な伸長条件 (MT (OS)) のいずれかに 6 日間さらされました。 培養4日目という早い段階で、肥大性バイオマーカーであるNT-ProBNPは、MT（正常）条件と比較してMT（OS）条件の培地中で有意に増加しました（図7a）。 さらに、6日間の培養後、MT（OS）の細胞サイズ（図7b）は、MT（正常）心臓切片と比較して有意に増加しました。 さらに、NFATC4の核移行は、過度に伸長した組織で有意に増加しました（図7c）。 これらの結果は、過度のストレッチング後の病理学的リモデリングの進行性の発達を示し、ストレッチ誘発性心肥大シグナル伝達を研究するためのプラットフォームとして CTCM デバイスを使用できるという概念の証明を提供します。

空気室の圧力、流体室の圧力、および組織の動きの測定の代表的なトレースにより、空気室の圧力が流体室の圧力を変化させ、対応する組織スライスの動きが誘発されることが確認されました。 b 通常の伸長 (オレンジ色) および過度に伸長した (青色) 組織スライスの伸長率と伸長率の代表的なトレース。 c サイクル時間（異なるブタからの n = 19 スライス/グループ）、収縮時間（異なるブタからの n = 18 ～ 19 スライス/グループ）、弛緩時間（異なるブタからの n = 19 スライス/グループ）の定量化を示す棒グラフ。 、組織運動の振幅 (異なるブタからの n = 14 スライス/グループ)、ピーク収縮速度 (異なるブタからの n = 14 スライス/グループ)、およびピーク弛緩速度 (n = 14 (D0)、15 (D6) スライス/グループ異なるブタからのもの）、両側スチューデント t 検定では、いずれのパラメーターにも有意な差は見られず、これらのパラメーターが 6 日間の過剰伸長培養にわたって一貫したままであることが実証されました。 エラーバーは平均値 ± SD を表します。

a MT 正常伸長 (Norm) または過剰伸長 (OS) 条件下で培養した心臓切片の培地中の NT-ProBNP 濃度の棒グラフ定量化 (n = 4 (D2 MTNorm)、3 (D2 MTOS、D4 MTNorm、および D4 MTOS))異なるブタからのスライス/グループ、二元配置分散分析を実行します; **通常のストレッチと比較して p < 0.01)。 b トロポニン-TおよびWGAで染色された心臓スライスの代表的な画像（左）および細胞サイズの定量化（右）（n = 330（D6 MTOS）、369（D6 MTNorm）細胞/グループ、異なるブタからの10の異なるスライスから、2-テール付きスチューデント t 検定を実行します; **** 通常のストレッチと比較して p < 0.0001)。 c トロポニン-TおよびNFATC4について免疫標識された0日目および6日目のMTOS心臓スライスの代表的な画像、およびCMの核へのNFATC4の転座の定量化（異なるブタからのn = 4（D0）、3（D6 MTOS）スライス/グループ） 、両側スチューデント t 検定が実行されます; *p < 0.05)。 エラーバーは平均値 ± SD を表します。

トランスレーショナル心臓血管研究には、心臓環境を忠実に再現できる細胞モデルが必要です。 この研究では、極薄の心臓スライスを刺激できる CTCM デバイスが開発され、特性が評価されました。 CTCM システムには、T3 および Dex による体液強化と組み合わせた生理学的同期電気機械刺激が含まれます。 ブタの心臓切片をこれらの因子に曝露することにより、生存率、構造的完全性、代謝活性、および転写発現はすべて、培養中の12日間、新鮮な心臓組織と同様に維持された。 さらに、心臓組織の過度のストレッチは、過度のストレッチ誘発性の心肥大を引き起こします。 全体として、これらの結果は、正常な心臓表現型の維持における生理学的培養条件の重要な役割を確認し、薬物スクリーニングのプラットフォームを提供します。

心筋細胞の機能と生存のための最適な環境には、複数の要因が寄与しています。 これらの因子のうち最も明白なものは、(1) 細胞間相互作用、(2) 電気機械刺激、(3) 体液性因子、および (4) 代謝基質に関連しています。 生理学的細胞間相互作用には、細胞外マトリックスによってサポートされる複雑な三次元多細胞型ネットワークの存在が必要です。 この複雑な細胞相互作用は、個々の細胞型を共培養して in vitro で再現することは困難ですが、心臓切片の器官型の性質を利用することで簡単に実現できます。

心筋細胞の機械的ストレッチングと電気刺激は、心臓の表現型を保存するために不可欠です 33,34,35。 機械的刺激は、hi​​PSC-CM のコンディショニングと成熟に広く使用されていますが、最近、いくつかのエレガントな研究で、一軸負荷を使用して培養中の心臓スライスの機械的刺激が試みられています 17、18、19。 これらの研究は、培養中の心臓表現型に対する 2D 一軸機械的負荷のプラスの影響を示しています。 これらの研究では、心臓スライスに等尺性伸張力 17 または線形自己緊張性負荷 18 を負荷するか、または力変換器フィードバックとストレッチャー アクチュエーター 19 を使用して心周期を再現します。 しかし、これらの方法では培地の条件を最適化せずに組織の一軸伸長を採用したため、複数の心臓遺伝子の下方制御または病理学的伸長反応に関連する遺伝子の過剰発現が生じました。 ここで説明する CTCM は、サイクル タイミングと生理学的ストレッチ (ストレッチ 25%、収縮期 40%、拡張期 60%、および毎分 72 拍) の点でネイティブの心周期を模倣する 3 次元電気機械刺激を提供します。 この 3 次元の機械的刺激だけでは組織の完全性を維持するには十分ではありませんが、組織の生存率、機能性、完全性を完全に維持するには、T3/Dex を使用した体液性刺激と機械的刺激の組み合わせが必要でした。

体液性因子は、成人の心臓表現型の制御において重要な役割を果たします。 このことは、細胞の成熟を促進するために培地に T3 と Dex を組み込む hiPS-CM 研究で強調されています。 T3 は、細胞膜を通過するアミノ酸、糖、カルシウムの輸送に影響を与える可能性があります 36。 さらに、T3 は MHC-α の発現と MHC-β の下方制御を促進し、胎児 CM に見られる遅筋原線維に対して成熟心筋細胞に見られる速筋原線維を促進します 37。 甲状腺機能低下症患者における T3 の欠如は、筋原線維横紋の喪失と緊張の発現速度の低下につながる可能性があります 37。 Dex はグルココルチコイド受容体に作用し、生体外灌流心臓の心収縮性を高めることが示されています 38。改善はストア作動性カルシウム流入 (SOCE) への効果に関連していると考えられています 39,40。 さらに、Dex はその受容体に結合します。 免疫機能や炎症を抑制する幅広い細胞内反応を誘導します30。

我々の結果は、生理学的機械刺激（MC）はCtrlと比較して全体的な培養パフォーマンスを向上させましたが、培養中で12日間生存率、構造的完全性、および心臓発現を維持できないことを示しています。 CTCM 培養 (MT) に T3 および Dex 処理を組み込むと、Ctrl と比較して生存率が向上し、新鮮な心臓組織と同様の転写プロファイル、構造的完全性、および代謝活性が 12 日間維持されました。 さらに、CTCM を使用した過伸張誘発性心肥大モデリングのモデルは、組織の伸張の程度を制御することによって達成され、CTCM システムの多用途性を示しています。 心臓のリモデリングと線維化には通常、関連するサイトカインや食作用、その他のリモデリング因子を提供できる循環細胞の寄与による無傷の臓器が関与しますが、心臓切片はストレスや傷害に応じて線維化プロセスをエミュレートできることに注意してください。常在線維芽細胞を筋線維芽細胞に分化させることによって。 これは、この心臓スライスモデルで以前に評価されました15。 CTCM パラメータは、圧力/電気振幅と周波数を変更することで、頻脈、徐脈、機械的循環補助 (機械的に負荷のない心臓) などの多くの状態をシミュレートするために調整できることに注意してください。 これにより、システムを薬物検査の中規模のスループット プラットフォームにすることができます。 CTCM は過伸展誘発性心肥大をモデル化できるため、このシステムを個別化された治療試験に利用する道が開かれます。 結論として、本研究は、培養中の心臓組織切片を維持するには、機械的ストレッチと体液性刺激が不可欠であることを実証しています。

ここに示すデータは、CTCM が無傷の心筋をモデル化するための非常に有望なプラットフォームであることを示していますが、この培養方法にはいくつかの制限があります。 CTCM 培養の主な制限は、連続的な動的機械的負荷がスライスに適用されるため、各サイクル中に心臓スライスの収縮を積極的に監視することができないことです。 さらに、心臓スライスのサイズが小さい (7 mm) ため、従来の力トランスデューサーを使用して培養系の外で収縮機能評価を実行する能力は限られています。 現在の原稿では、収縮機能の読み取り値としての光学ひずみの評価を通じて、この制限を部分的に克服しています。 ただし、この制限にはさらなる研究が必要であり、将来的には、カルシウムや電圧感受性色素を使用した光学マッピングなど、培養内の心臓スライスの機能を光学的に監視する方法を実装することで対処できる可能性があります。 CTCM のもう 1 つの制限は、作業モデルが生理学的圧力 (前負荷と後負荷) を操作していないことです。 CTCM では、圧力が反対方向に誘導され、特大の組織の拡張期 (全長の伸び) と収縮期 (電気刺激中の収縮した長さ) の生理学的伸びを 25% 再現します。 この制限は、将来の CTCM 設計において、心臓組織を両側から完全に加圧し、心腔内で生じる正確な圧力と体積の関係を適用することによって対処される必要があります。

この原稿で報告されている過剰伸長誘発リモデリングは、過剰伸長肥大シグナル伝達のみをエミュレートすることに限定されています。 したがって、このモデルは、体液性因子または神経因子（このシステムには欠如している）なしで、伸張誘発性の肥大性シグナル伝達を研究するのに役立つ可能性があります41,42。 免疫細胞との共培養、循環体液性血漿因子、および神経細胞共培養との神経支配など、CTCM の疾患モデリング能力を向上させるなど、CTCM に多重性を追加するにはさらなる研究が必要です。

今回の研究では13頭のブタが使用された。 すべての動物手順は施設のガイドラインに従っており、ルイビル大学施設内動物管理使用委員会によって承認されました。 大動脈弓をクランプし、心臓を 1 L の滅菌心停止溶液 (110 mM NaCl、1.2 mM CaCl2、16 mM KCl、16 mM MgCl2、10 mM NaHCO3、5 単位/ml ヘパリン、pH 7.4) で灌流しました。 心臓は、氷上の研究室に輸送されるまで（通常は10分未満）、氷冷した心停止溶液中で保存した。

CTCM デバイスは、SolidWorks コンピュータ支援設計 (CAD) ソフトウェアで設計されました。 培養チャンバー、分離プレート、および空気チャンバーは、透明なアクリルプラスチックから CNC (コンピューター数値制御) 加工を使用して製造されました。 7 mm のサポート リングは高密度ポリエチレン プラスチック (HDPE) から中心旋盤加工され、下のメディアをシールするシリコン O リングを収容するための O リング溝が取り付けられています。 薄いシリコン膜が培養チャンバーを分離プレートから分離します。 シリコーン膜は、デュロメータ 35 Åの 0.02 インチのシリコーン シートからレーザーカットされました。底部と上部のシリコーン ガスケットは、デュロメータ 50 Åの 1/16 インチのシリコーン シートからレーザーカットされました。316 L ステンレス鋼のネジと蝶ナットを使用してデバイスを固定し、気密シールを作成しました。

カスタム プリント基板 (PCB) は、C-PACE-EM システムと統合するように設計されました。 PCB 上のスイス マシン ヘッダーのアウトレットは、銀メッキ銅線と電極にねじ込まれた 0 ～ 60 の青銅ネジを介してグラファイト電極に接続されています。 PCB は 3 次元印刷されたデバイス カバーに適合します。

CTCM デバイスは、心周期と同様の制御された周期圧力を誘導できるプログラム可能な空気圧ドライバー (PPD) によって制御されます。 空気室内の圧力が上昇すると、柔軟なシリコン膜が上方に膨張し、組織スライスの下の培地が移動します。 次に、組織スライスはこの流体の変位によって伸ばされ、拡張期中の生理的な心臓の伸張を模倣します。 この拡張期のピークでは、グラファイト電極を介して電気刺激が加えられ、気室の圧力が低下し、組織切片が収縮します。 航空会社内には、空気システムの圧力を検出する圧力プローブ センサーを備えた止血弁があります。 圧力センサーによって検出された圧力は、ラップトップに接続されたデータ収集デバイスに供給されます。 これにより、空気室内の圧力を継続的に監視することができます。 最大空気室圧力 (標準の場合は 80 mmHg、OS の場合は 140 mmHg) に達すると、データ収集デバイスは、4 V に設定された 2 ms の二相電圧信号を誘導する信号を C-PACE-EM システムに送信するように指示されます。 。

心臓スライスを取得し、6 ウェル培養条件を以下のように実行しました。収集した心臓を移送容器から冷 (4 °C) 心臓麻痺溶液を含むトレイに移します。 左心室を滅菌ブレードを使用して分離し、1 ～ 2 cm3 のブロックに切断します。 これらの組織ブロックは、組織接着剤を使用して組織サポーターに取り付けられ、連続酸素化 (3 g/L 2,3-ブタンジオン モノキシム (BDM)、140 mM NaCl (8.18 g)、 6 mM KCl (0.447 g)、10 mM D-グルコース (1.86 g)、10 mM HEPES (2.38 g)、1 mM MgCl2 (1 mL の 1 M 溶液)、1.8 mM CaCl2 (1.8 mL の 1 M 溶液)、最大 1 L の ddH2O)。 振動ミクロトームは、周波数 80 Hz、水平振動振幅 2 mm、および前進速度 0.03 mm/s で 300 μm のスライスを切断するように設定されています。 組織バスは氷で囲まれ、冷却された溶液を維持し、温度を 4 °C に保ちます。 組織切片をミクロトーム槽から、1枚の培養プレートに十分な切片が得られるまで、氷上の連続酸素化タイロード溶液を含む保持槽に移す。 トランスウェル培養条件では、組織切片を滅菌済みポリウレタン 6 mm 幅サポートに貼り付け、6 mL の最適化された培地 (Medium 199、1x ITS サプリメント、10% FBS、5 ng/mL VEGF、10% 培地) を含む 6 ウェル培養プレートに配置します。 ng/mL FGF-basic、および 2X 抗生物質-抗真菌薬)。 電気刺激 (10 V、1.2 Hz のペース) を C-Pace 蓋を通して組織スライスに適用しました。 TD 条件の場合、培地交換ごとに新鮮な T3 および Dex を 100 nM および 1 μM の濃度で添加しました。 1 日 3 回、すべての培地を交換する前に、培地に酸素を供給します。 組織切片は、37 °C、5% CO2 に設定されたインキュベーター内で培養されました。

CTCM 培養では、改変タイロード液を含むペトリ皿内のカスタム 3 次元プリント装置上に組織切片を配置しました。 このデバイスは、サポート リング領域の 25% だけ心臓スライスを大きくするように設計されています。 これは、心臓スライスがタイロード液から培地に移された後、および拡張期中に過度に伸ばされないことを保証するために行われます。 ヒストアクリル接着剤を使用して、厚さ 300 μm のスライスを直径 7 mm のサポート リングに固定しました。 組織スライスがサポート リングに取り付けられたら、余分な組織スライスを切り取り、1 つのデバイスに十分なスライスが準備されるまで、取り付けられた組織スライスを氷 (4 °C) 上のタイロード溶液バスに戻しました。 処理時間は、すべてのデバイスの合計で 2 時間を超えてはなりません。 6 つの組織スライスをサポート リングに取り付けたら、CTCM デバイスを組み立てました。 CTCM 培養チャンバーには、21 mL の酸素添加済み培養培地を事前に充填しました。 組織切片を培養チャンバーに移し、すべての気泡をピペットで注意深く取り除きました。 次に、組織切片をウェルに導き、所定の位置に静かに押し込みました。 最後に、電極カバーをデバイス上に置き、デバイスをインキュベーターに移しました。 次に、CTCM をエア チューブと C-PACE-EM システムに接続しました。 空気圧ドライバーのスイッチがオンになり、CTCM デバイスへのエアフロー バルブが開きました。 C-PACE-EM システムは、2 ms の二相刺激で 1.2 Hz で 4 V を提供するように設定されました。 電極からの黒鉛の蓄積を避けるために、培地を１日２回交換し、電極を１日１回交換した。 必要に応じて、組織切片を培養ウェルから取り出して、下に閉じ込められている可能性のある気泡を追い出します。 MT条件の場合、100nM T3および1μM Dexで培地交換ごとにT3/Dex処理を新たに追加しました。 CTCM デバイスは、37 °C、5% CO2 に設定されたインキュベーター内で培養されました。

カスタムカメラシステムは、心臓スライスのストレッチトレースを取得するために開発されました。 DSLR カメラ (Canon Rebel T7i、Canon、東京、日本) を Navitar Zoom 7000 18-108 mm マクロ レンズ (Navitar、カリフォルニア州サンフランシスコ) とともに使用しました。 新鮮な培地に交換した後、室温でイメージングを実施した。 カメラは 51° の角度で配置され、ビデオは 30 fps で記録されました。 まず、オープンソース ソフトウェア (MUSCLEMOTION43) を Image-J とともに使用して、心臓スライスの動きを定量化しました。 マスクは MATLAB (MathWorks、米国マサチューセッツ州ナティック) を使用して作成され、ノイズを避けるために鼓動する心臓スライスの対象領域を定義しました。 手動でセグメント化されたマスクはフレーム シーケンス内のすべての画像に適用され、MUSCLEMOTION プラグインに供給されました。 筋肉の動きは、各フレーム内の平均ピクセル強度を使用して、参照フレームに対する動きを定量化します。 データは記録され、フィルタリングされ、サイクル時間を定量化し、心周期中の組織の伸びを評価するために使用されました。 記録されたビデオの後処理は、ゼロ位相一次デジタル フィルターを使用して実行されました。 組織の伸び（ピークからピーク）を定量化するために、記録された信号の山と谷を区別するためにピーク分析が実行されました。 さらに、6 次多項式を使用して信号ドリフトを除去するためにトレンド除去が実行されました。 ソフトウェア コードは、組織全体の動き、サイクル タイム、弛緩時間、収縮時間を検出するために MATLAB で開発されました (補足ソフトウェア コード 44)。

ひずみ解析では、機械的ストレッチ評価用に生成されたのと同じビデオを使用して、まず、MUSCLEMOTION ソフトウェアに従って動きのピーク (動きの最高点 (上) と最低点 (下)) を表す 2 つの画像を追跡しました。 次に、組織領域をセグメント化し、セグメント化された組織にシェーディングアルゴリズム45の形状を適用しました（補足図2a）。 次に、セグメント化された組織が 10 個のサブサーフェスに分割され、各サーフェスのひずみが次の方程式を使用して計算されます。 ひずみ = (Sup − Sdown)/Sdown ここで、Sup と Sdown は、上下の組織のシェーディングからの形状の距離です。 、それぞれ（補足図2b）。

心臓切片を 4% パラホルムアルデヒドで 48 時間固定しました。 固定組織は、10%、次に 20% スクロースで 1 時間、続いて 30% スクロースで一晩脱水を受けました。 次に、スライスを最適切断温度コンパウンド (OCT コンパウンド) に埋め込み、イソペンタン/ドライアイス浴で徐々に凍結させました。 OCT 包埋ブロックは、切片作成まで -80 °C で保存されました。 スライドを厚さ 8 μm の切片に調製しました。

心臓スライスから OCT を除去するために、スライドをヒートブロック上で 95 °C で 5 分間加熱しました。 1 mLのPBSを各スライドに添加し、室温で30分間インキュベートした。次いで、切片を、PBS中の0.1% Triton-Xを用いて室温で15分間放置することによって透過処理した。 非特異的抗体がサンプルに結合するのを防ぐために、1 mL の 3% BSA 溶液をスライドに添加し、室温で 1 時間インキュベートしました。 次いで、BSAを廃棄し、スライドをPBSで洗浄した。 ワックスペンを使用して、各サンプルに印を付けました。 一次抗体 (1% BSA で 1:200 希釈) (Connexin 43 (Abcam; #AB11370)、NFATC4 (Abcam; #AB99431)、および Troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) がセクションに追加されました。 90 分間、続いて二次抗体 (1% BSA で 1:200 希釈) 抗マウス Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079)、抗ウサギ Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) をさらに 90 分間分離PBS で 3 回洗浄し、ターゲットの染色をバックグラウンドから区別するために、コントロールとして二次抗体のみを使用しました 最後に、DAPI 核染色を追加し、スライドを vectashield (Vector Laboratories) にマウントし、マニキュアで密封しました免疫蛍光イメージングは​​、Cytation 1ハイコンテンツイメージャ(レンズ倍率20倍)およびレンズ倍率40倍のキーエンス顕微鏡を使用して実施した。

WGA 染色には、WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) を PBS 中で 5 μg/mL で使用し、室温で 30 分間固定切片に適用しました。 次いで、スライドをＰＢＳで洗浄し、スーダンブラックを各スライドに添加し、３０分間インキュベートした。 次いで、スライドをＰＢＳで洗浄し、ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤を添加した。 スライドは、Keyence 顕微鏡で 40 倍のレンズ倍率を使用して画像化されました。

ＯＣＴは、上記のようにサンプルから除去された。 OCTを取り外したら、スライドをブアン溶液に一晩浸しました。 次いで、スライドを蒸留水で１時間リンスし、その後、ビーブリッヒ・スカーレット酸フクシン溶液に１０分間入れた。 次いで、スライドを蒸留水で洗浄し、５％リンモリブデン酸／５％リンタングステン酸溶液中に１０分間置いた。 リンスせずに、スライドを直接アニリンブルー溶液に15分間移した。 次に、スライドを蒸留水ですすぎ、1%酢酸溶液中に2分間入れました。 スライドを200プルーフのエチルアルコール中で乾燥させ、キシレンに移した。 染色されたスライドは、レンズ倍率 10 倍の Keyence 顕微鏡を使用して画像化されました。 線維症の面積の割合は、Keyence Analyzer ソフトウェアを使用して定量化されました。

CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA)、カタログ番号 V13154 を、いくつかの変更を加えて製造業者のプロトコールに従って使用しました。 詳細には、MTT アッセイを実行するときに同様の組織サイズを確保するために 6 mm の外科用パンチが使用されました。 メーカーのプロトコールに従って、組織をそれぞれ、MTT基質を含む12ウェルプレートのウェルに配置した。 スライスを 37 °C で 3 時間インキュベートし、生​​存組織が MTT 基質を代謝して紫色のホルマザン化合物を生成しました。 MTT 溶液を 1 ml の DMSO に置き換え、37 °C で 15 分間インキュベートして、心臓切片から紫色のホルマザンを抽出しました。 透明な底の96ウェルプレート内でサンプルをDMSOで1:10に希釈し、Cytationプレートリーダー(BioTek)を使用して570nmで紫色の強度を測定した。 測定値は、各心臓スライスの重量に対して正規化されました。

以前に記載されているように、グルコース利用アッセイのために、心臓切片の培地を、1μCi/ml [5-3H]-グルコース（Moravek Biochemicals、Brea、CA、USA）を含む培地に交換した。 4時間のインキュベーション後、100μlの0.2N HClを含むキャップのない微量遠心管に100μlの培地を加えた。 次に、チューブを 500 μl の dH2O が入ったシンチレーションバイアルに入れて、[3H]2O を 37 °C で 72 時間蒸発拡散させました。 次に、微量遠心分離管をシンチレーションバイアルから取り出し、10mlのシンチレーション液を加えた。 シンチレーション計数は、Tri-Carb 2900TR 液体シンチレーション アナライザー (Packard Bioscience Company、メリデン、コネチカット州、米国) を使用して実行されました。 次いで、[5-3H]-グルコースの比活性、不完全な平衡およびバックグラウンド、未標識グルコースに対する[5-3H]-の希釈、およびシンチレーションカウンター効率を考慮して、グルコース利用を計算した。 データは心臓スライスの重量に対して正規化されました。

Trizol中で組織を均質化した後、Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874を製造業者のプロトコールに従って使用することにより、心臓切片からRNAを単離した。 RNAseq ライブラリーの調製、配列決定、およびデータ分析は以下のように実行されました。

サンプルあたり 1 μg RNA を RNA ライブラリー調製の入力材料として使用しました。 配列決定ライブラリーは、メーカーの推奨に従って NEBNext UltraTM RNA Library Prep Kit for Illumina (NEB、USA) を使用して生成し、インデックス コードを追加して各サンプルの配列を属性化しました。 簡単に説明すると、ポリ T オリゴ結合磁気ビーズを使用して、mRNA を全 RNA から精製しました。 断片化は、NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X) 中で高温下で二価カチオンを使用して実行されました。 第１鎖ｃＤＮＡは、ランダムヘキサマープライマーおよびＭ－ＭｕＬＶ逆転写酵素（ＲＮａｓｅ Ｈ－）を使用して合成した。 続いて、DNA ポリメラーゼ I および RNase H を使用して、第 2 鎖 cDNA 合成を実行しました。残りのオーバーハングは、エキソヌクレアーゼ/ポリメラーゼ活性によって平滑末端に変換されました。 DNA断片の3'末端をアデニル化した後、ヘアピンループ構造を持つNEBNextアダプターをライゲーションし、ハイブリダイゼーションの準備をしました。 長さ 150 ～ 200 bp の cDNA 断片を優先的に選択するために、ライブラリ断片を AMPure XP システム (Beckman Coulter、Beverly、USA) で精製しました。 次に、3μlのUSER酵素（NEB、米国）を、サイズ選択され、アダプター連結されたcDNAとともに37℃で15分間使用し、続いてPCR前に95℃で5分間使用した。 次に、Phusion High-Fidelity DNA ポリメラーゼ、Universal PCR プライマー、および Index (X) プライマーを使用して PCR を実行しました。 最後に、PCR 産物を精製し (AMPure XP システム)、ライブラリの品質を Agilent Bioanalyzer 2100 システムで評価しました。 次に、Novaseq シーケンサーを使用して cDNA ライブラリーの配列を決定します。 Illumina からのオリジナル画像データ ファイルは、CASAVA 塩基認識 (Base Calling) によって RAW 読み取りに変換されます。 生データは、一連のリードと対応する基本品質を含む FASTQ(fq) 形式のファイルに保存されます。 HISAT2 は、フィルター処理されたシーケンスリードを参照ゲノム Sscrofa11.1 にマッピングするために選択されます。 一般に、HISAT2 は、40 億塩基を超えるゲノムを含むあらゆるサイズのゲノムをサポートし、ほとんどのパラメーターはデフォルトに設定されます。 RNA Seq データのスプライシングされたリードは、現在利用可能な最速のシステムである HISAT2 を使用して、他の方法と同等以上の精度で効果的にアライメントできます。

転写物の豊富さは遺伝子発現レベルを直接反映します。 遺伝子発現レベルは、ゲノムまたはエクソンにマッピングされた転写物の存在量 (配列決定の数) によって推定されます。 リード数は、遺伝子発現レベル、遺伝子長、およびシーケンスの深さに比例します。 FPKM (配列決定された百万塩基対あたりの転写配列のキロベースあたりの断片数) を計算し、DESeq2 パッケージを使用して差次的発現 P 値を決定しました。 次に、組み込みの R 関数「p.adjust」に基づいて Benjamini-Hochberg 法 9 を使用して、各 P 値の誤検出率 (FDR) を計算しました。

心臓切片から抽出した RNA を、Thermo の SuperScript IV Vilo Master mix (Thermo、カタログ番号 11756050) を使用して 200 ng/μl の濃度で cDNA に変換しました。 qRT-PCR は、Applied Biosystems microamp Endura プレート光学 384 ウェル透明反応プレート (Thermo、カタログ番号 4483319) と microamp 光学接着フィルム (Thermo、カタログ番号 4311971) を使用して実行しました。 反応混合物は、5 μl Taqman Fast Advanced Master mix (Thermo、カタログ番号 4444557)、0.5 μl Taqman Primer、およびウェルあたり 3.5 μL H2O から構成されます。 標準的な qPCR サイクルを実行し、Applied Biosystems Quantstudio 5 リアルタイム PCR 装置 (384 ウェル ブロック、製品番号 A28135) を使用して CT 値を測定しました。 Taqman プライマーは Thermo から購入しました (GAPDH (Ss03375629_u1)、PARP12 (Ss06908795_m1)、PKDCC (Ss06903874_m1)、CYGB (Ss06900188_m1)、RGL1 (Ss06868890_m1)、ACTN1 (Ss01009508_) mH)、GATA4 (Ss03383805_u1)、GJA1 (Ss03374839_u1)、COL1A2 (Ss03375009_u1) )、COL3A1 (Ss04323794_m1)、ACTA2(Ss04245588_m1) すべてのサンプル CT 値は、ハウスキーピング遺伝子 GAPDH に対して正規化されました。

培地中の NT-ProBNP 放出は、メーカーのプロトコルに従って NT-ProBNP キット (ブタ) (カタログ番号 MBS2086979、MyBioSource) を使用して評価しました。 簡単に言うと、250 μL の各サンプルと標準を各ウェルに 2 回ずつ加えました。 サンプルの添加直後に、ウェル当たり５０μＬの検出試薬Ａを添加した。 プレートを穏やかに振盪し、プレートシーラーでシールした。 次に、プレートを 37 °C で 1 時間インキュベートしました。 次に、溶液を吸引し、ウェルを 350 μL の 1X 洗浄溶液で 4 回洗浄し、洗浄溶液を毎回 1 ～ 2 分間インキュベートしました。 次に、細胞あたり 100 μL の検出試薬 B を添加し、プレートシーラーで密封しました。 プレートを穏やかに振盪し、37℃で30分間インキュベートした。 溶液を吸引し、ウェルを350μLの1X Wash Solutionで5回洗浄した。 90μLの基質溶液を各ウェルに添加し、プレートを密閉した。 プレートを37℃で10〜20分間インキュベートした。 50μLの停止溶液をウェルごとに加えた。 450 nmに設定したCytationプレートリーダー(BioTek)を使用して、プレートを直ちに測定した。

検出力分析を実行して、パラメータの 10% の絶対変化を 5% のタイプ I エラー率で検出するために >80% の検出力を提供するグループ サイズを選択しました。 組織切片は実験前にランダムに選択されました。 すべての分析は条件に関して盲検化され、サンプルはすべてのデータが分析された後にのみデコードされました。 GraphPad Prism ソフトウェア (カリフォルニア州サンディエゴ) を使用して、すべての統計分析を実行しました。 すべての統計について、p 値は値 <0.05 で有意であるとみなされます。 両側スチューデント t 検定は、2 つのグループのみを比較してデータに対して実行されました。 一元配置または二元配置 ANOVA を使用して、複数のグループ間の有意性を決定しました。 Tukey 補正は、事後テストを実行する際の複数の比較を考慮して適用されました。 RNAseq データには、方法セクションで要約されているように、FDR と p.adjust を計算するために特別な統計的考慮が必要でした。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

著者らは、この研究の結果を裏付けるすべてのデータが論文およびその補足情報ファイル内で入手可能であることを宣言します。 RNAseq データと各図のデータポイントについては、補足データ 1 の Excel ファイルを参照してください。 さらに、RNAseq 生データは、受託番号 GSE211110 で GEO リポジトリに保管されています。

著者らは、この研究の結果を裏付けるすべてのデータが論文およびその補足情報ファイル内で入手可能であることを宣言します。 補足ソフトウェア コード ファイルには、分析で使用されるコンピューター コードが示されています。 ソフトウェア コードは Zenodo44: https://doi.org/10.5281/zenodo.7023518 に寄託されました。

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著者らは、この研究を可能にした資金提供機関に感謝したい。TMAM は、NIH 助成金 R01HL147921 および P30GM127607、および米国心臓協会助成金 16SDG29950012 によって支援されている。 著者らはまた、NIH 助成金 F32HL149140 (RREA)、P30GM127607 (BGH)、R01HL130174 (BGH)、R01HL147844 (BGH)、R01ES028268 (BGH)、P01HL78825 (RB、BGH)、UM1HL113530 (RB)、および 2U54HL を認めています。 120163. また、米国国防総省の助成金 W81XWH-20-1-0419 (TMAM) にも感謝します。

Jessica M. Miller、Moustafa H. Meki の著者も同様に貢献しました。

米国ルイビル大学医学部分子心臓学研究所より

ジェシカ・M・ミラー、ムスタファ・H・メキ、チンフイ・オウ、リハム・RE・アブレイサ、シアンリャン・タン、アブー・バクル・M・サラマ、アフマド・ゲブレイル、シンディ・リン、ロベルト・ボリ、テイマー・MA・モハメド

ルイビル大学生物工学科（米国ルイビル）

ジェシカ・M・ミラー、ムスタファ・H・メキ、アーメド・エルナキブ、ヒシャム・アブデルタワブ、ファーミ・ハリファ、アイマン・S・エルバズ、グルプラサド・A・ギリダラン、テイマー・MA・モハメド

ザガジグ大学医学部、ザガジグ、エジプト

アブ・バクル・M・サラマ

ルイビル大学医学部、糖尿病・肥満センター、環境研究所、ルイビル、米国

ブラッドフォード G. ヒル & テイマー MA モハメド

AnaBios Corporation、サンディエゴ、米国

ナジャ・アビ・ゲルゲス

ルイビル大学薬理学・毒物学科（米国ルイビル）

テイマー・MA・モハメド

マンチェスター大学心臓血管科学研究所、マンチェスター、イギリス

テイマー・MA・モハメド

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JMM および MHM: 実験計画、分子および細胞データの収集と分析、原稿執筆、および原稿の最終承認。 AE: ひずみ解析を実行しました。 QO: 心臓の切断、染色、および画像化。 XL.T.、RB: 豚の心臓の収集と原稿執筆、RREA および BGH: 代謝分析。 AS、CL、および AG: 免疫染色およびトリクローム染色および分析。 HA、FK、NA、および ASE: 心臓スライス組織の完全性に関する人工知能分析。 GG: CTCM と機械的刺激の工学設計と監督。 TMAM: 作品全体の構想とデザイン、および資金の提供。 著者全員が原稿執筆と原稿の最終承認に貢献しました。

Tamer MA Mohamed への通信。

TMAM は Tenaya Therapeutics の株式を保有しています。 GG は NuPulseCV について相談します。 NA は最高科学責任者であり、アナビオスの株式を保有しています。 他のすべての著者は、競合する利害関係を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた Aida Oliván-Viguera と他の匿名の査読者に感謝します。 主な編集者: Ngan Huang と Eve Rogers。 査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Miller, JM、Meki, MH、Elnakib, A. 他 ex vivo で心臓生理学および病態生理学をエミュレートする生体模倣心臓組織培養モデル (CTCM)。 Commun Biol 5、934 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s42003-022-03919-3

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受信日: 2022 年 2 月 7 日

受理日: 2022 年 8 月 30 日

公開日: 2022 年 9 月 9 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-03919-3

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