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Nov 29, 2023

ADAMTSL3 ノックダウン

Edizione di biologia della comunicazione

Communications Biology volume 5、記事番号: 1392 (2022) この記事を引用

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心不全は世界中で罹患率と死亡率の主な原因であり、圧力過負荷によって生じる可能性があり、心臓リモデリングは心筋細胞の肥大と死、線維化、炎症を特徴とします。 不全心臓では、トランスフォーミング成長因子 (TGF) β が心臓線維芽細胞 (CFB) を筋線維芽細胞に分化させ、過剰な細胞外マトリックスの産生と心臓リモデリングを引き起こします。 心不全における病理学的TGFβシグナル伝達を標的とする新しい戦略が必要である。 今回我々は、分泌された糖タンパク質ADAMTSL3が心臓内のTGFβを調節していることを示す。 われわれは、Adamtsl3 ノックアウトマウスでは、死亡率の増加とともに心機能不全の悪化と拡張が起こり、大動脈バンディングによる圧迫過負荷後に心臓が TGFβ 活性と CFB 活性化の増加を示すことを発見した。 さらに、培養CFBにおけるADAMTSL3の過剰発現は、TGFβシグナル伝達、筋線維芽細胞の分化およびコラーゲン合成を阻害することから、TGFβ活性およびCFB表現型を調節することによるADAMTSL3の心臓保護的役割が示唆される。 これらの結果は、心不全におけるADAMTSL3の潜在的な有益な効果についての将来の研究を保証するものである。

心不全は世界中で罹患、入院、死亡の主な原因となっており、人口の 2 ～ 3% が罹患しています1。 圧力過負荷がかかると、心筋は心筋細胞の肥大や死、線維化、炎症などの特徴的な病態生理学的反応を伴って再構築され、多くの場合、拡張型心不全に先立って肥大性の増殖が起こります2。

細胞外マトリックス (ECM) は心臓の構造的および機能的完全性を維持するために重要であり、心臓線維芽細胞 (CFB) は心臓における ECM の主な生産者です 3。 心不全中、CFB は活性化され、高度に増殖し ECM を産生する筋線維芽細胞 3,4 に分化転換し、α-平滑筋アクチン (α-SMA) の強力な発現を特徴とします 5,6。 このプロセスは創傷治癒に重要ですが、過剰な CFB 活性化は、心臓線維症におけるコラーゲン沈着と架橋の増加に起因する、成長因子の活性化、炎症、電気伝導度の低下、心筋の硬さの増加を通じて、病的な心臓リモデリングを促進します 3,7。 トランスフォーミング成長因子 (TGF)β は CFB の活性化に必要であり 5、心不全における魅力的な治療標的となります 8。 しかし、直接的な TGFβ 阻害はオフターゲット効果によって制限されており 9,10、心不全の転帰を改善するには心臓における TGFβ 媒介 CFB 活性化についてのより深い理解が必要です。

マトリセルラータンパク質は、心臓 ECM7 で動的に発現される非構造制御分子です。 我々は最近、母細胞タンパク質の 7 員ファミリーであるトロンボスポンジン 1 型モチーフ様タンパク質を含むディスインテグリン様およびメタロプロテアーゼ ドメイン (ADAMTSL) タンパク質が、実験的および臨床的心不全において上方制御されていることを特定しました 11。 ADAMTSL は構造的に ADAMTS ECM プロテアーゼ 12 に関連していますが、触媒ドメインを欠いているため、その生物学的機能はほとんど不明です。 いくつかのADAMTSLがフィブリリンミクロフィブリルと潜在的TGFβ結合タンパク質（LTBP）1に結合して制御し、ECM内でTGFβを隔離するため、蓄積されている証拠はTGFβ制御における役割を示しています13、14。 ADAMTSL 遺伝子の変異体は、一貫した分子的特徴として調節不全の TGFβ シグナル伝達を伴う線維症の表現型を模倣します 11、15、16、17。

ここでは、圧力過負荷の心臓における ADAMTSL3 を調査するために使用した、Adamtsl3 を標的として不活化したマウス (L3-KO) の生成と特性評価を報告します。 われわれは、L3-KO マウスが大動脈バンディング (AB) 誘発圧過負荷後に心機能不全と拡張を発症し、死亡率が高く、TGFβ 活性と CFB 活性化が増加することを発見した。 培養ヒト CFB における ADAMTSL3 の過剰発現は、TGFβ 活性と筋線維芽細胞の変換を阻害し、その結果 ECM 発現とコラーゲン合成が減少しました。

ADAMTSL3発現は、大動脈弁狭窄症患者のLVで2倍上方制御され（AS、図1a）、虚血性DCM（iDCM）患者の心筋では、ADAMTSL3 mRNAとタンパク質が1.5倍上方制御されました（図1b〜c）。 ）。 患者の特徴は以前に報告されており、左室肥大、線維症、駆出率が維持された心不全（HFpEF）を伴う症候性ASを有する患者18、または駆出率が低下した線維化および拡張型心不全（HFrEF）を伴う末期DCMを有する患者が含まれる19。 同様に、Adamtsl3 発現は、固定直径 O リング 20 を使用して、最近記載された AB 手順を 1 週間または 6 週間受けた WT マウスの LV で 2 ～ 3 倍増加しました（図 1d）。 マウスでは機能する抗体が欠如しているため、ADAMTSL3 タンパク質レベルは調査されませんでした（図 S1a-b）。

ab 大動脈弁狭窄症（AS、n = 11）および虚血性拡張型心筋症（iDCM、n = 9）の患者からの左心室（LV）生検における ADAMTSL3/RPL32 mRNA レベルとそれぞれの対照の比較。 c iDCM患者（n = 8）対対照（n = 7）のLVにおけるADAMTSL3タンパク質/総タンパク質レベルのウェスタンブロットおよび定量化。 d 大動脈バンディング（AB）または偽手術の1週間後および6週間後の野生型（WT）マウスのLVにおけるAdamtsl3 / Rpl32 mRNAレベル（1週間でn = 5偽およびn = 7 AB、n = 8偽およびn = 6週間で12AB）。 e ヘマトキシリン核対比染色（紫）を使用した、AB および偽手術マウスの左心房、および AB 後 4 週間の AB マウスの LV 壁における Adamtsl3 mRNA（赤色染色）の in situ ハイブリダイゼーション。 f Genotype-Tissue Expression (GTEx) プロジェクト ポータルからの RNA シーケンス データ。 GTEx では、948 人の死亡したヒト臓器提供者からの 54 の非罹患組織にわたる合計 17,382 のサンプルが対照集団に相当します。 ドナーの年齢は20～70歳、女性33％、白人85％、アフリカ系アメリカ人13％。 ADAMTSL3 発現は、LV (n = 432、TPM 中央値 = 2.54) および左心耳 (LAA、n = 429、TPM 中央値 = 9.66) における 100 万キロベースあたりの転写産物 (TPM) として示されています。 g 生後 1 ～ 3 日のラット心臓から単離された、内皮細胞 (nrEC) が存在する新生児ラット心臓線維芽細胞 (nrCFB) および心筋細胞 (nrCM) における Adamtsl3 の mRNA レベル (n = 60 心臓の n = 3 単離、n = 分離ごとに 3 つの培養を繰り返します)。 h 未処理の初代nrCFBおよび5 ng IFN-γで刺激したnrCFBにおけるAdamtsl3のmRNAレベル。 データは散布図 (a ～ d、g ～ h) または平均 ± SEM のバイオリン プロット f です。 統計分析は、スチューデントの t 検定とそれぞれの対照 (a ～ d、g ～ h) を使用して実行されました。 i EMBL-EBI Single Cell Expression Atlas からのデータ。 20 匹のマウス組織 (10 ～ 15 週齢の雌マウス n = 3 匹、雄マウス n = 4 匹) からの 82 種類の細胞を含むすべてのクラスターと、内皮細胞、心筋細胞、線維芽細胞および間葉細胞 (線維芽細胞前駆細胞) の抽出が示されています。 Adamtsl3 発現のクラスター化 (青い点)。 スケール バーは、マッピングされた 100 万あたりの読み取り数 (CPM) です。

WTマウスの心臓におけるRNA in situハイブリダイゼーションにより、心房組織と心室組織の両方でAB後のAdamtsl3発現が確認され（図1e）、心筋細胞（CM）間の領域でAdamtsl3発現が示されました。 同様に、ADAMTSL3は、遺伝子型組織発現（GTEx）データベース21の948人のヒトドナーのLVおよび左心耳（LAA）で発現されました（図1f）。 我々は、CFB が CM から分離された新生ラットの心臓から初代培養物を取得し、CM 画分には血管内皮細胞 (EC) が見つかりました 11。 qPCR分析により、CM / ECと比較してCFBでのAdamtsl3発現が高いことが明らかになり（図1g）、CFBでのその発現はインターフェロン-γ（IFN-γ）によって上方制御され（図1h）、IFN-γシグナル伝達がADAMTSL3産生を刺激することを示唆していますCFBで。 注目すべきことに、CM / EC画分におけるAdamtsl3のCT値は比較的高かったため（図S2）、したがって、CM / EC画分におけるAdamtsl3発現は非常に低いと考えられました。 また、20 個のマウス組織からの 82 種類の細胞の公開発現データを含む Single Cell Expression Atlas データベースもマイニングしました 22。 我々の初代心臓培養からのデータと一致して、線維芽細胞および間葉細胞（線維芽細胞前駆細胞）クラスターで高いAdamtsl3 mRNAレベルが見られました（図1i）。 EC ではある程度の発現が見られましたが、CM では発現は無視できました。 これに基づいて、nrCM/nrEC 画分の Adamtsl3 シグナルはおそらく EC に由来すると考えられます。 これらの独立したデータセットは、ヒト、マウス、ラットの心臓における ADAMTSL3 の主な生産者として線維芽細胞を特定します。

CRISPR-Cas9媒介遺伝子編集を使用して、Adamtsl3変異マウス対立遺伝子が生成されました（図2a）。 具体的には、シグナルペプチドをコードするエクソン 2 の 5 bp 欠失 (図 2b) により、フレーム外の転写産物が生じ、Adamtsl3 の発現が消失しました。 ホモ接合マウスとヘテロ接合マウスは、Adamtsl3 遺伝子型解析、RNA-seq、および qPCR によって区別できました（それぞれ図 S3a ～ c​​）。 成体Ｌ３−ＫＯマウスは、外見的には正常な外観を有し（図Ｓ３ｄ）、体重はＷＴ対照と同様であった（表ＳＩ〜ＳＩＩ）。 ホモ接合性Ｌ３−ＫＯマウスは、明らかな早期致死性を示さずに成熟まで生存し、８〜１２週齢で心エコー検査および心臓ＭＲＩで測定したところ、明らかに正常な心臓の寸法および機能を有していた（表ＳＩ）。 注目すべきことに、L3-KO心臓はWT(9～13%)およびヘテロ接合体(13.5%)同腹子の心臓よりも重かった(表SI～SII)。 L3-KO脛骨の骨はWT同腹子の骨よりも長かった(2〜3%)ため、ベースラインでの器官重量の正規化には脛骨の長さよりも、3つの遺伝子型すべてで同様の体重の方が優先された(表SI〜SII)。 。

a – b Adamtsl3 変異対立遺伝子の生成。 コーディングエクソンと非コーディングエクソンを示すAdamtsl3遺伝子座の概要。 CRISPR-Cas9 媒介編集により、エクソン 2 に 5 bp の欠失が生じました。 b 5 bp 欠失の標的部位周辺の配列。 下線を引いた配列は、遺伝子型解析に使用したプライマーを示します。 c マウス研究の概略タイムライン。 野生型（WT）マウスとAdamtsl3ノックアウト（L3-KO）マウスに大動脈バンディング（AB）手術または偽手術を受け、心エコー検査と磁気共鳴画像法（MRI）で6週間追跡調査した。 d AB後のカプラン・マイヤー生存曲線。 e ABまたは偽手術後のWTおよびL3-KOにおけるベースラインからの体重（BW）の変化（%）（n = 8 WTおよびn = 12 L3-KO）。 f AB 後の絶対心臓重量 (HW)。 g AB 後の左心室質量 (LVM)。 h 拡張期の心室中隔の厚さ (IVSd)、i 拡張期の LV 後壁の厚さ (LVPWd)、j ベースラインおよび偽と比較した AB 後の拡張期の LV 内径 (LVIDd)。 k AB 後の LV 拡張末期容積 (LVEDV)。 l ベースラインおよびAB後の短縮率（FS）。 m AB 後の LV 駆出率 (LVEF)。 n 偽と比較したベースラインでの左心房 (LA) 直径。 o L3-KO および AB 後の WT における絶対肺重量 (LW)。 p AB または偽手術から 6 週間後の LV 心房および脳のナトリウム利尿ペプチド (Nppa、Nppb) および α- および β-ミオシン重鎖 (Myh6、Myh7)。 e–pn = 6 WT および n = 6 L3-KO ベースライン時、n = 12 WT および n = 8-12 L3-KO 後 AB、および n = 7-8 WT および n = 9-12 L3-KO 後偽手術。 データは平均値 ± SEM です。 統計分析は、ログランク (マンテル-コックス) 検定 (d)、テューキーの多重比較検定を使用した一元配置分散分析 (e、h – j、l、n、p)、またはスチューデントの t 検定 ( f – g、k、m、o)。 P 値は数値 p 値、または AB 対シャムの場合は *p < 0.05、**p < 0.01、および ***p < 0.001、$p < 0.05、$$p < 0.01、および $$ として報告されます。 L3-KO AB 対 WT AB の $p < 0.001。

L3-KO および WT の同腹子には、内径 0.55 mm の固定 O リングを使用した AB による LV 後負荷の増加が与えられ、対応する対照コホートでは偽手術が行われました 20。 マウスは、ベースラインと術後1、3、6週間に心エコー検査とMRIでモニタリングされ、心臓はAB後1週間と6週間で採取されました（図2c）。 L3-KOマウスはAB後の死亡率が高く、6週間後の生存率は62％であったのに対し、WTの生存率は96％であり、両方の遺伝子型の偽手術マウスの生存率は100％でした（図2d）。 死亡した L3-KO マウスの大部分は、AB 後 3 週間で重度の心機能不全を起こして死亡しました。 両方の遺伝子型はベースラインで同様の体重を有し、AB対偽手術マウスと比較して体重が減少しましたが、AB後の時間経過にわたってWTはL3-KOよりも多くの体重を再増加しました（図2e）。 6週間後、生き残ったL3-KOはベースライン体重の10％を失ったため（図2e）、実験は終了しました。 この体重減少は、AB後のWTに対するL3-KOにおけるより有害な影響と一致していた。

L3-KO マウスは AB 後に WT マウスよりも多く体重が減少したことを考慮すると、採取後の臓器重量は体重に対して正規化されていませんでした。 採取されたL3-KO心臓は、WT心臓よりもAB後の重量が重く（図2f）、MRI測定された寸法から計算される絶対LV質量がより大きかった（図2g）。 心エコー検査によって測定された心室中隔の厚さ（IVSd）（図2h）とLV後壁の厚さ（LVPWd）（図2i）は、ベースラインでは同様であり、AB後1週間で両方の遺伝子型で増加しており、同様の程度の肥大化を示唆しています応答。 しかし、AB後6週間では、WTでは肥大がまだ明らかでしたが、L3-KOでは心室壁が薄くなり、ベースラインと変わりませんでした（図2h〜i）。 心エコー検査によって測定されたLV内径（LVIDd）（図2j）、およびMRIによって測定されたLV容積（LVEDV）（図2k）は、試験後1週間から6週間までの研究期間を通じて、WTと比較してL3-KOで増加しました。 AB、WTと比較してL3-KOの心臓拡張の増加を示します（代表的な心エコー検査画像を図S4a〜bに示します）。 L3-KOは、AB後1週間からWTと比較して短縮率（FS）が減少し（図2l）、LVEFが減少しました（図2m）。これは、収縮機能の低下を示しています。 左心房（LA）直径（図2n）および肺重量（図2o）は、AB後6週間のL3-KOで増加しており、循環うっ血を示唆しています。 最後に、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ANP、Nppa）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（BNP、Nppb）、およびβ-ミオシン重鎖（Myh7）の発現は、6週間の時点でL3-KO対WT LVで増加しました（図2p）。進行中の心筋細胞のリモデリングと機能不全を伴う23。 まとめると、これらのデータは、L3-KO は、同様に LV 後負荷がかかった場合に、WT と比較して心拡張と収縮機能不全の悪化を引き起こし、代償不全への進行がより速いことを示しています。

LV圧過負荷に応答するADAMTSL3の役割を理解するために、AB後1週間のLVでRNA-seq分析を実行しました。このとき、両方の遺伝子型が心肥大を示しましたが、L3-KO心臓のみが拡張していました（図2）。 L3-KO LVでは、138個が上方制御され、95個が下方制御され、合計233個の差次的発現遺伝子（DEG）が、偽発見率（FDR）<0.05で同定されました（補足データ1）。 21の京都遺伝子とゲノム百科事典（KEGG）経路がDEGから同定され、最も豊富な10経路には心筋症、CM機能、細胞-ECM相互作用が含まれていました（図3a）。 遺伝子オントロジー（GO）分析により、110の生物学的経路、50の分子機能、および51の細胞成分カテゴリーの濃縮が明らかになり、最も濃縮された10カテゴリーのうち、いくつかは心臓の収縮性とリモデリング、細胞-ECM相互作用、およびTGFβシグナル伝達に関連していることが明らかになりました（図3b） –d)。 したがって、公平な RNA-seq 解析により、心機能不全の悪化に伴う経路の強化と ADAMTSL3 の ECM 調節的役割が明らかになりました。 重要なことに、L3-KO 心臓で最も上方制御されている遺伝子には、心筋細胞のリモデリングと機能不全と一致する Nppa と Myh7 が含まれ、23、I 型コラーゲン (Col1a1) とペリオスチン (Postn) が含まれており、これらのレベルは TGFβ シグナル伝達に反応し、線維症の増加を示しています 24 (図 3e–g)。 Ingenuity 経路分析 (IPA、Qiagen) は、MEF2C と TGFβ をそれぞれ CM および CFB 関連 DEG の主要な上流制御因子 (USR) として予測しました (図 3h-i、補足データ 1)。

Adamtsl3 ノックアウト (L3-KO、n = 10) および野生型 (WT、n = 6) マウスに、1 週間の大動脈バンディング (AB) および RNA シーケンスによって左心室 (LV) の圧過負荷を誘発しました。 LV組織に対して実施されました。 233 個の発現差のある遺伝子 (DEG、FDR < 0.05) を、注釈、視覚化、統合発見データベース (DAVID) v6.8 分析ウィザードを使用して、京都遺伝子およびゲノム百科事典 (KEGG) 経路および遺伝子オントロジー (GO) 用語を強化するために分析しました49。 。 233 DEG の中で同定された、最も濃縮された 10 個の a KEGG 経路、b GO 生物学的経路、c GO 分子機能、および d GO 細胞成分が示されています。 e L3-KO と WT の間の 233°のキロベース 100 万あたりのログ読み取り数 (RPKM) を比較する散布図。 赤い点は、グラフ内の注釈付き DEG に対応します。 DEG (灰色と赤色の点) の完全なリストは補足データ 1 にあります。 fg 心筋細胞 (CM) の構造と機能 (f)、細胞外マトリックス (ECM) および心臓に関連する DEG の平均 RPKM の Log2 倍変化線維症(g)。 hi Ingenuity Pathway Analysis (IPA) からの DEG の上流制御因子の予測。

RNA-seq データのバイオインフォマティクス分析により、AB 後 1 週間の L3-KO 心臓における TGFβ 活性の増加が示されたため、我々は活性型 TGFβ および TGFβ シグナル伝達の重要なメディエーターである pSMAD2 のレベルをイムノブロッティングによって測定しました5。 活性型TGFβのレベルは、AB後1週間および6週間でWTと比較してL3-KO心臓で高かった（図4a）。 AB の 1 週間後、pSMAD2 は偽と比較して L3-KO 心臓で増加し、AB の 6 週間後、pSMAD2 は WT と比較して L3-KO 心臓で高くなりました (図 4b)。これは、L3-KO における TGFβ シグナル伝達の増加を示しています。 KOハート。 これと一致して、L3-KO心臓は6週間でTGFβ（Tgfb1）およびTGFβシグナル伝達の下流標的である結合組織増殖因子（Ctgf）の発現増加を示した（図4c）。 Postnは両方のABグループで同等に増加しましたが、Ltbp1はすべてのグループで変化しませんでした（図4c）。

a〜c 野生型（WT）マウスとAdamtsl3ノックアウト（L3-KO）マウスに、合計6週間の大動脈バンディング（AB）または偽手術を施しました。 a、b LV ライセート中の活性 TGFβ1/総タンパク質 (a) およびリン酸化 SMAD2 (pSMAD2)/総 SMAD2 (b) の代表的な免疫ブロットおよび定量化、1 週間 (偽: n = 4 WT および n = 4 KO、AB: n = 6-8 WT および n = 12 KO）および AB 後 6 週間（偽：n = 4 WT および n = 4 KO、AB：n = 12 WT および n = 8 KO）。 c AB マウスと AB 6 週間後の偽マウスにおける TGFβ (Tgfb1)、結合組織増殖因子 (Ctgf)、ペリオスチン (Postn)、および潜在型 TGFβ 結合タンパク質 1 (Ltbp1) の mRNA / Rpl32 レベル (偽: n = 8 WT およびn = 8 KO、AB: n = 10 WT および n = 7 KO)。 統計分析は、Tukey の多重比較検定による一元配置 ANOVA を使用して実行されました。AB 対シャムの場合は *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001、$p < 0.05、$$p でした。 L3-KO AB 対 WT AB では < 0.01、$$$p < 0.001。 dk 7 日間培養して豊富な細胞外マトリックス (ECM) ネットワークを生成し、4 日目に ADAMTSL3 (L3) またはコントロール (ビヒクル、Veh) アデノウイルスを形質導入したヒト胎児心臓線維芽細胞。データは 3 つの異なる細胞継代からの実験を表します。 d Veh (n = 9) および L3 (n = 11) ライセートにおける ADAMTSL3/総タンパク質の代表的な免疫ブロットと定量。 e 84 個の TGFβ 関連遺伝子の発現アレイを使用した、プールされた L3 対 Veh mRNA サンプル中の 62 個の下方制御および 22 個の上方制御された遺伝子 (両グループ n = 18)、データは GAPDH に対して正規化された ΔΔCT 値です。 f – g L3（n = 16）対Veh（n = 18）におけるTGFB1、LTBP1、CTGF、POSTN（f）およびMALAT1（g）のqPCRからのmRNA / RPL4レベル。 h – k pSMAD2/SMAD2 (h)、活性型 TGFβ1/総タンパク質 (i)、潜在性大型複合体 (LLC、> 250 kDa) (j) を含む潜伏関連タンパク質 (LAP)/総タンパク質の代表的な免疫ブロットと定量。 LLC (k) を含む潜在的 TGFβ 結合タンパク質 (LTBP1)/GAPDH、L3 (n = 8-9) と Veh (n = 8) の細胞および細胞外マトリックス ライセートの比較。 統計分析は、スチューデントの t 検定 (d、fk) を使用して実行されました。 すべてのデータ (e を除く) は、平均値 ± SEM の個別値の散布図として示されます。

さらなるメカニズムの洞察のために、我々は、広範なECMネットワークを形成するヒト胎児CFB（hfCFB）の培養物中で全長ADAMTSL3（L3）およびビヒクル対照アデノウイルス（veh）を過剰発現させた（図S5a）。 ADAMTSL3の過剰発現は、mRNA（図S5b）およびタンパク質（図4d）の増加によって確認されました。 プールされたL3およびVehサンプルでTGFβシグナル伝達経路の84個の遺伝子を標的とする発現アレイを使用して、L3で62個の下方制御遺伝子と22個の上方制御遺伝子を発見しました（図4e）。 標準的な TGFβ シグナル伝達のいくつかの中心メディエーター、たとえば TGFB1、TGFB2、SMAD3、SMAD4、TGFBR1 は下方制御され、TGFβ シグナル伝達阻害剤 SMAD6 は上方制御されました。 個々の L3 および Veh サンプルを分析したところ、大型潜在型 TGFβ 複合体 (LLC) の構成要素である TGFB1 および LTBP1、TGFβ シグナル伝達標的である CTGF および POSTN、および TGFβ シグナル伝達エンハンサー MALAT125 をコードする遺伝子が下方制御されていることが判明しました。 L3 (図 4f-g)。 イムノブロッティングにより、pSMADの減少（図4h）および活性型TGFβの減少（図4i）が明らかになり、TGFβシグナル伝達の減少が示されました。 さらに、TGFB1遺伝子から転写された潜伏関連ペプチド（LAP）からなるLLCおよびLTBP1のレベルは、L3細胞およびECMライセート中で減少し（図4j〜k）、TGFβ産生の減少を示しています。 機能喪失および機能獲得の研究を総合すると、ADAMTSL3 が in vivo の心臓および in vitro の心臓線維芽細胞における TGFβ シグナル伝達の阻害剤であることが示唆されます。

心筋機能を評価するために、組織相マッピング (TPM) 心臓 MRI が実行されました。 どちらの遺伝子型も、AB後に縦方向および円周方向のピークひずみの減少を発症し、収縮機能不全を示唆しています（図S6a-b）。 さらに、両方の遺伝子型は早期拡張期ひずみ率（SRe）の低下を示し、弛緩効果が低いことを示し（図S6c〜d）、3週間でL3-KOはWTと比較してLV周囲SReの低下を示しました（図S6d）。 ドップラー心エコー検査は、ピーク僧帽弁流入速度（E）（図S6e）および僧帽弁流入減速度（MVD）（図S6f）がL3-KOで減少したため、WTと比較してL3-KOにおける心機能の相対的な障害を裏付けました。 L3-KO における SRe の低下は、心筋線維症に関連している可能性がある LV 硬直を反映している可能性があります。 したがって、次のステップとして、ECM 遺伝子発現と生合成に対する ADAMTSL3 の効果を評価しました。

RNA-seqデータでは、AB後1週間でWTと比較してL3-KOでCol1a1が上方制御されていることがわかり（図3g）、この時点でのコラーゲン産生の増加が示唆されました。 したがって、我々は、WT マウスと L3-KO マウスの心室中央部における線維症の証拠を探しました。 AB の 1 週間後、トリクローム染色では、両方の遺伝子型で同等のコラーゲン レベル、つまり、WT のコラーゲン 9% および L3-KO コラーゲン 11% に対して、偽対照の 0.2 ～ 0.3% を示しました（図 5a および図 5 の代表的な画像）。 S7a)。 また、AB後1週間のLVのヒドロキシプロリンレベルによってコラーゲンIタンパク質含有量を定量しました。これは、組織学と一致して、ABと偽の後のL3-KOおよびWTのコラーゲン含有量の同様の増加を示しました（図5b） 。 AB 後 6 週間で、qPCR で評価したところ、コラーゲン I (Col1a1 および Col1a2) およびコラーゲン III (Col3a1) の mRNA は両方の遺伝子型で同程度に増加しました (図 5c)。 同様に、心室中央切片のトリクローム染色は両方の遺伝子型で同等でした、すなわち、AB後6週間でWTでは5.5％コラーゲン、6.4％L3-KOでした（図5dおよび図S7bの代表画像）。 したがって、AB後に調査された2つの時点で、遺伝子型間の組織コラーゲン量に差異は見出されませんでした。

a〜f 野生型（WT）マウスとAdamtsl3ノックアウト（L3-KO）マウスに、大動脈バンディング（AB）または偽手術を1週間および6週間施した。 a AB 後 1 週間の心室中央部のピクロシリウス レッド、ファスト グリーン、およびアルシアン ブルー (RGB) で染色した組織切片から計算した左心室 (LV) 総コラーゲン % (偽: n = 5 WT および n = 5 KO、 AB: n = 5 WT および n = 5 KO）。 b AB 後 1 週間後にピークヒドロキシプロリン HPLC によって測定した LV I 型コラーゲン含量 (偽: n = 6 WT および n = 5 KO、AB: n = 6 WT および n = 7 KO)。 c I型コラーゲン（Col1a1、Col1a2）およびIII型（Col3a1）およびリシルオキシダーゼ（Lox）のLV mRNA / Rpl32レベル（偽：n = 8 WTおよびn = 8 KO、AB：n = 10 WTおよびn = 7）コ）。 d AB後6週間の心室中央切片のLV %総コラーゲン（偽：n = 3 WTおよびn = 3 KO、AB：n = 4 WTおよびn = 4 KO）。 e 心室中央切片の比色法および酵素的手順を使用した、AB後6週間のLVの総コラーゲン、可溶性コラーゲン、不溶性コラーゲンおよびコラーゲン架橋のレベル（n = 7 WTおよびn = 7 KO）。 （ f ）L3-KO対WTにおけるフィブリリン-1 / 2（Fbn1、Fbn2）、トロポエラスチン（Eln1）およびフィブロネクチン-1（Fn1）のmRNA / Rpl32レベル（偽：n = 8 WTおよびn = 8 KO、 AB: n = 10 WT および n = 7 KO）。 統計分析は、Tukey の多重比較検定 (a ～ d、f) または Student の t 検定 (e) を使用した一元配置分散分析を使用して実行されました。 P 値は正確な p 値、または AB 対シャムの場合は *p < 0.05、**p < 0.01、および ***p < 0.001、$p < 0.05、$$p < 0.01、および $$ として報告されます。 L3-KO AB 対 WT AB の $p < 0.001。 g–h、j ヒト胎児心臓線維芽細胞 (hfCFB) を 7 日間培養して豊富な細胞外マトリックス (ECM) ネットワークを生成し、4 日目に ADAMTSL3 (L3) またはコントロール (溶媒、Veh) アデノウイルスを形質導入しました。データは実験を表しています。 3 つの異なる細胞継代で。 g 78個の細胞接着およびECM関連遺伝子の発現アレイを使用した、プールされたL3対Veh mRNAサンプル（両グループn = 18）中の53個の下方制御遺伝子および25個の上方制御遺伝子のΔΔCT発現値（GAPDHに対して正規化）。 h L3 (n = 16) 対 Veh (n = 18) の COL1A1、COL1A2、COL3A1、LOX の qPCR からの mRNA / RPL4 レベル。 i 生後 1 ～ 3 日のラットから単離された、L3 および Veh CFB に 48 時間かけて取り込まれた [3H]-プロリンの放射性崩壊 (1 分あたりのカウント) によって測定されたコラーゲンタンパク質合成 (n = 3 単離、n = 60)単離ごとに n = 3 ～ 4 の技術的複製を与える心臓）。 j L3 (n = 16) 対 Veh (n = 18) hfCFB における FBN1、FBN2、ELN、および FN1 の qPCR からの mRNA / RPL4 レベル。 統計分析は、スチューデントの t 検定 (hj) を使用して実行されました。 すべてのデータ (g を除く) は、平均値 ± SEM の個別値の散布図として表示されます。

リシルオキシダーゼ（Lox）mRNAは、AB後6週間でWTと比較してL3-KOで1.7倍増加しました（図5c）。これは、L3-KOにおけるコラーゲン架橋の増加を示す可能性があります。 したがって、心室中央部の切片で比色分析および酵素分析を使用して、AB 後 6 週間の総コラーゲン含有量、可溶性コラーゲン含有量、および不溶性コラーゲン含有量を分析しました。 重要なことに、L3-KO LVは、WTと比較して、より高いレベルの不溶性コラーゲンを有していた(図5e)。 ただし、計算されたコラーゲン架橋の差（不溶性コラーゲンと可溶性コラーゲンの比）は、遺伝子型間で有意差（p = 0.139）に達しませんでした（図5e）。

ADAMTSL3 が in vitro で ECM 発現を調節するかどうかを調べるために、78 個の ECM および細胞接着遺伝子を標的とする発現アレイを使用したところ、L3 と Veh のプールされたサンプルで 53 個の下方制御遺伝子と 25 個の上方制御遺伝子が見つかりました。 いくつかの細胞接着遺伝子（SELL、SELP、PECAM1、VCAM1など）が上方制御されました。 L3-KO AB心臓における発現の増加と一致して、L3ではCOL1A1、ITGB1およびCTGFが下方制御され、いくつかの分泌メタロプロテイナーゼおよび細胞表面マトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP）およびADAMTSプロテアーゼも同様でした（図5g）。 個々の hfCFB サンプルでは COL1A1 発現の減少が確認されましたが、COL3A1 は変化していませんでした (図 5h)。 コラーゲンタンパク質の生成は、放射性標識プロリンの取り込みを使用して、発達中のECMを使用してL3対Veh nrCFBでさらに調査されました（図S5c〜d）。 重要なことに、L3培養物にはVehよりも放射性プロリンが25％少ないことがわかり（図5i）、ADAMTSL3が心臓線維芽細胞のコラーゲンタンパク質レベルを阻害することを示唆しています。 L3-KO心臓におけるLox発現の増加（図5c）と一致して、hfCFBにおけるL3過剰発現はLOX mRNAを減少させ（図5h）、ADAMTSLがコラーゲン架橋を阻害する可能性があることを示唆しています。 AB後6週間のL3-KO心臓では、エラスチン（Eln）の発現はVehよりも1.8倍高かったが、フィブリリン（Fbn1 / 2）およびフィブロネクチン（Fn1）の発現は変化しなかった（図5f）。 最後に、広範なミクロフィブリルネットワークを生成するhfCFB培養物でミクロフィブリル発現を分析しました11、L3とVehではFBN1、FBN2、ELN、およびFN1の発現の減少が示されました（図5j）。 特に、フィブロネクチンフィブリルは、コラーゲン I、フィブリリンミクロフィブリル、エラスチン、LTBP-1 の ECM26 への集合をサポートします。 まとめると、我々のデータは、ADAMTSL3 が、hfCFB 培養物におけるコラーゲンの合成と架橋、および圧力過負荷に応答した他の構造 ECM 分子の合成に影響を与えることを示しています。

オステオポンチン（SPP1）は筋線維芽細胞の分化に必須であり、L3対Vehの発現アレイで最も下方制御された分子として同定されたため（図5g）、したがって、WTおよびL3-KO心臓における筋線維芽細胞の分化を調べました。 AB後1週間と6週間で、筋線維芽細胞のサインマーカーα-SMA（Acta2）の発現レベルが群間で同等であることがわかりました（図6a）が、α-SMAタンパ​​ク質のイムノブロッティングでは、L3-KOの2.5倍の増加が明らかになりました。 AB 後 1 週間の WT との比較 (図 6b)、筋線維芽細胞の分化の増加を示しています。 SPP1発現は、AB後の両方の遺伝子型で増加し、WTと比較してL3-KO心臓でより高いレベルであり（図6c）、これはタンパク質レベルでもさらに確認されました（図6d）。 ACTA2発現は、Vehと比較してL3 hfCFB培養物において40％減少し（図6e）、α-SMAタンパ​​ク質は25％減少した（図6f）。 個々のL3 hfCFBサンプルにおけるSPP1がVehレベルの10％まで下方制御され（図6g）、Vehと比較してオステオポンチンタンパク質が40％減少していること（図6h）を確認し、筋線維芽細胞の分化の低下を示しました。 次に、活性化 CFB の線維化促進の特徴、つまり増殖と ECM6 を収縮させる獲得能力が調査され、増殖細胞マーカーである増殖細胞核抗原 (PCNA)、Ki-67 (KI67)、およびミニL3の染色体維持複合体コンポーネント2（MCM2）（図6i）、およびEdUの取り込みの減少（図6j）。 最も重要なことは、ADAMTSL3を過剰発現する細胞はコラーゲンゲルを収縮する能力の低下を示し（図6k）、筋線維芽細胞の分化障害の機能的読み取りを提供しました。

a〜d 野生型（WT）マウスとAdamtsl3ノックアウト（L3-KO）マウスに、1週間および6週間の大動脈バンディング（AB）または偽手術を施しました。 a α-平滑筋アクチン (α-SMA、Acta2) の mRNA/Rpl32 レベル。 b AB または偽手術後 1 週間および 6 週間後の WT および L3-KO の LV タンパク質抽出物中の α-SMA の代表的な免疫ブロットと定量。 c オステオポンチン (OPN、Spp1) の mRNA/Rpl32 レベル。 d ABまたは偽手術の1週間後および6週間後のWTおよびL3-KOのLVタンパク質抽出物における代表的なイムノブロットおよびOPNの定量。 AB 後 1 週間では、n = 4 ～ 5 WT および n = 4 KO 偽、n = 6 ～ 7 WT および n = 8 ～ 9 KO AB。 AB 後 6 週間では、n = 4-8 WT および n = 4-8 KO 偽、n = 10-12 WT および n = 7-8 KO AB。 統計分析は、Tukey の多重比較検定 (ad) を備えた一元配置分散分析を使用して実行されました。 P 値は、AB 対シャムの場合は *p < 0.05、**p < 0.01、および ***p < 0.001、および AB 対シャムの場合は $p < 0.05、$$p < 0.01、および $$$p < 0.001 として報告されます。 L3-KO AB vs. WT AB。 e-k ヒト胎児心臓線維芽細胞（hfCFB）を7日間培養して豊富な細胞外マトリックス（ECM）ネットワークを生成し、4日目にADAMTSL3（L3）またはコントロール（媒体、Veh）アデノウイルスを形質導入しました。実験は3日目に行われました。異なる細胞継代。 e L3 (n = 16) 対 Veh (n = 18) の ACTA2/RPL4 レベル。 f L3 (n = 8) 対 Veh (n = 8) におけるα-SMA / GAPDH の代表的な免疫ブロットと定量。 g L3 (n = 16) 対 Veh (n = 18) の SPP1/RPL4 レベル。 f L3 (n = 8) 対 Veh (n = 8) の代表的なイムノブロットおよび OPN/総タンパク質の定量。 i L3 (n = 18) 対 Veh (n = 18) における増殖細胞核抗原 (PCNA)、増殖マーカー Ki-67 (KI67) およびミニ染色体維持複合体成分 2 (MCM2) の mRNA レベル/RPL4。 j 増殖の尺度として、L3 対 Veh における EdU の取り込みを反映する相対蛍光単位 (RFU) (n = 48)。 データは平均値 ± SEM (a – j) で示されています。 k hfCFBのコラーゲンゲル収縮（初期ゲル面積の％収縮として）、L3（n = 12）対Veh（n = 24）における2、4、および6時間で。 統計分析は、スチューデントの t 検定 (p – k) を使用して実行され、p 値は数値 (e – j) または **p < 0.01 および ***p < 0.001 として報告され、二元配置反復測定が行われました。複数の時点を比較するためのガイサー・グリーンハウス補正を使用した分散分析 (k、グラフに示されている正確な p 値)。

AB 後の L3-KO 心臓における収縮性の低下と一致して、RNA-seq により、リアノジン受容体 (Ryr2)、タイチン (Ttn)、ナトリウム-カルシウム交換体 (NCX、Slc8a1)、SERCA などの調節不全の CM サルコメアおよび収縮性遺伝子が明らかになりました。 （Atp2a2）およびホスホランバン（Pln）（図3e-g）。 したがって、我々は成体 WT マウスおよび L3-KO マウスから単離された CM を調査しました。 CMは遺伝子型間で同様のサイズであり（図S8a）、同等の静止サルコメア長でした（図S8b）。 1 Hzの電気ペーシング中、CMは同様の収縮の大きさを示し、イソプロテレノールチャレンジによる平行細胞短縮（図S8c）、同様の収縮（図S8d）および弛緩（図S8e）動態を示し、L3での正常なCM発達を示唆しています。 KOハート。 分離されたCMの表現型はWTとL3-KOで類似しており、CMではAdamtsl3発現が検出されなかったため（図1i）、AB後のL3-KOで観察された収縮機能不全の悪化は、ECMとCFBの変化に続発すると解釈されました。関数。

本研究では、心不全患者からの生検におけるADAMTSL3の調節と、L3-KOおよびWT同腹子マウスにおけるAB誘発性LV圧過負荷後の心臓リモデリングにおけるADAMTSL3の役割を調査した。 ADAMTSL3 は、AB 後の患者およびマウスの不全心臓で上方制御され、主に CFB によって産生されました。 重要なことは、L3-KO マウスは収縮機能不全と左室拡張の悪化を示し、左室圧過負荷後の死亡率が高かったことです。 AB後のL3-KOおよびWT心臓の分子分析により、L3-KOにおける不溶性コラーゲンのレベルの増加に伴い、TGFβシグナル伝達の増加、CFB活性化、および調節不全のECM産生が明らかになった。 培養CFBにおけるADAMTSL3の過剰発現は、TGFβシグナル伝達、筋線維芽細胞変換、ECM発現およびコラーゲン合成を阻害した。 まとめると、我々のデータは、不全心臓におけるADAMTSL3の心臓保護的役割は、TGFβ活性と筋線維芽細胞の分化の阻害を介して、心臓ECM、心臓リモデリング、病原体刺激時の機能に影響を与えることを示唆しています。

心不全患者からの心臓生検ではADAMTSL3レベルが上昇しており、マウスを用いた我々の研究は心機能と生存に対するADAMTSL3の重要な役割を実証している。 LV の圧力過負荷の後、L3-KO は悪化した収縮機能不全と心臓拡張を発症しました。 AB後の心臓のRNA配列により、心筋症、CMカルシウム処理、L3-KOの収縮性に関連するDEGが明らかになった。 CMではAdamtsl3発現が検出されず、単離されたL3-KOとWT CMの間でCM機能に差は見られなかったため、L3-KOにおける心機能の低下はCFBによるECM制御の変化に続発すると解釈しました。

ベースラインでは、L3-KO マウスは生存しており、手足がわずかに長いことを除いて明らかな表現型はなく正常な体重を持っていました。 心エコー検査およびMRIで測定したベースラインの心臓機能または寸法はAdamtsl3不活化による影響を受けなかったが、ストレスを受けていないL3-KOマウスの心臓の重量は増加していた。 これは、L3-KO 心臓はストレッサーに反応して疾患を悪化させる傾向がある可能性があるため、AB 後の心臓表現型の解釈には注意が必要であることを示しています。

Importantly, our study directly links ADAMTSL3 to cardiac function. This link was previously suggested, as ADAMTSL3 is part of a rare syndrome known as Tetrasomy 15q25, arising from an inverted duplication of the distal chromosome 15qter identified with SNP microarray in a patient with multiple anomalies including complex cardiovascular malformation. Am. J. Med. Genet. A 158a, 1971–1976 (2012)." href="/articles/s42003-022-04361-1#ref-CR27" id="ref-link-section-d79610379e2679"> 27、28。 患者の特徴には、高い死亡率に関連する成長異常や複雑な心臓奇形が含まれます28。 表現型の心臓欠陥は、ADAMTSL3 が染色体重複の一部である場合にのみ現れます 28。 心臓欠陥は、ADAMTSL329,30 など、同じ領域のヘテロ接合性染色体微小欠失を持つ患者でも報告されています。

ADAMTSL ファミリーのメンバーとフィブリリンミクロフィブリルの間の機能的関係 13、15、17 は、ADAMTSL が TGFβ の制御因子であることを示唆しており、この機能は ADAMTSL211、31 および ADAMTSL614 で以前に実証されています。 私たちの研究は、AB後のL3-KO心臓におけるTGFβのレベルと活性の増加、およびADAMTSL3を過剰発現する培養CFBにおけるTGFβの阻害を示すため、ADAMTSLタンパク質がTGFβ調節に関与することを示す証拠の増加に加えられる。 TGFβ は不全心臓における CFB 活性化と線維化促進 ECM 産生の主要な調節因子である 7,32 ため、このことは ADAMTSL3 が心臓における線維化および病原性シグナル伝達の負の調節因子であることを示唆している可能性があります。 ADAMTSL3 はマウス心臓および培養ヒト CFB における CFB 活性化を制御し、これは ADAMTSL3 の過剰発現に応答した CFB 収縮の障害と並行して、筋線維芽細胞マーカーである α-SMA およびオステオポンチンのレベルの変化によって示されました。 培養ヒト CFB では、ADAMTSL3 の過剰発現により、コラーゲンを含む ECM 分子の発現が変化しました。 in vivoでは心臓の総コラーゲンの変化は見られませんでしたが、Adamtsl3の不活化により心筋内のECMの質が変化し、不溶性コラーゲンのレベルが増加したため、これはLoxの発現亢進に起因すると考えられると考えられます。 最近の証拠は、機能不全に陥った心臓には活性化された CFB の特徴的な集団が含まれており、高度な収縮性や高度なコラーゲン産生などのさまざまな特性を保持していることを示唆しています 4,33。 我々は、ADAMTSL3 が、単なるコラーゲン産生以外の方法で心筋を再構築する特定の筋線維芽細胞集団の分化に影響を与える可能性があると推測しています。 実際、損傷した心臓からの活性化された筋線維芽細胞では、30 を超える調節不全の ECM 遺伝子が同定されています 34。 CFB における ADAMTSL3 過剰発現の後、FBN1、FBN2、FN1、および ELN の発現が減少することがわかり、潜在的な TGFβ 複合体を隔離する ECM タンパク質の制御が示唆されました。 それに応じて、L3-KO心臓においてEln発現が増加した。

TGFβ は心疾患の潜在的な治療標的として長い間魅力的でしたが、臨床応用は副作用によって制限されており 32、TGFβ 経路阻害の代替戦略が必要です 35。 さらに、筋線維芽細胞の分化は機能不全の心臓において可逆的であることが示されており 35 、重要な治療標的となる可能性がある。 ADAMTSL3 が筋線維芽細胞の分化阻害の治療的可能性を保持しているかどうかはまだわかっていません。 機構的には、ADAMTSL3 はフィブリリン-1 および LTBP113 に結合し、TGFβ 活性を調節する潜在的な機構を示しています。 我々は、ADAMTSL3 が、おそらく ADAMTSL211 と連携して、ECM における TGFβ のバイオアベイラビリティを制限すると考えられます。 我々はさらに、心臓における TGFβ および線維化促進シグナル伝達の負の制御因子である IFN-γ を、ADAMTSL3 の上流制御因子として提案します。

結論として、圧力過負荷後の L3-KO マウスの死亡率の増加と心臓表現型の悪化は、不全心臓における ADAMTSL3 の心臓保護的な役割を示唆しています。 機構的に、我々の結果は、ADAMTSL3がTGFβ活性化と筋線維芽細胞分化の制限を介して心臓機能をサポートしていることを示しています。 今後の研究では、心臓病モデルで実験的にADAMTSL3レベルを増加させ、潜在的な心臓保護効果を明らかにすることで、この可能性に対処できる可能性がある。

ヒト心臓生検の使用は、ノルウェー南東部地域保健局の医療研究倫理地域委員会 (REK ID 07482a、および 2010/2226) によって承認されており、ヘルシンキ宣言に従っています。 すべての患者、またはドナー対照の近親者は、書面によるインフォームドコンセントに署名した。 生検はオスロ大学病院 (OUH) で行われ、すべての患者は病院のガイドラインに従って標準的な臨床評価、治療、追跡調査を受けました。 マウスモデルと実験は、クリーブランドクリニック IACUC (プロトコル番号 2020-2450) およびノルウェー国立動物研究委員会 (承認 ID 16614) によって承認され、NIH の実験動物の管理と使用に関するガイド、および動物研究を報告するためのARRIVEガイドライン。

症候性 AS 患者から、大動脈弁置換のための開心手術中に LV 遊離壁生検 (n = 11) が採取されました。 対照ＬＶ生検（ｎ＝１１）は、冠状動脈疾患の手術を受ける患者の正常に収縮している組織から採取された。 患者の特徴は以前に説明されています18。 簡単に言うと、すべての患者の EF > 50% でした。 AS 患者は、非拡張 LV (LVIDd 4.81 ± 0.23 cm) および肥大性 LV 壁 (IVSd 1.26 ± 0.06 cm および LVPWd 1.22 ± 0.07 cm) を持っていました。 サンプル材料が限られているため、このコホートからは RNA のみが単離されました。

続発性虚血性 DCM 患者 (n = 20) の LV 生検は、外植直後の鼓動する心臓から採取されました。 移植を検討したが外科的理由により拒否された、病気のない心臓からのLV組織を対照として使用した(n = 3 RNAおよびn = 7タンパク質サンプル)。 患者とドナーの特徴は以前に説明されました19。 簡単に言うと、心臓は拡張し（LVIDd 7.41 ± 0.22 cm）、収縮機能が低下し（LVEF 19.2 ± 1.6%）、壁は肥大していませんでした（それぞれ IVSd 0.81 ± 0.05 cm および LVPWd 0.71 ± 0.02 cm）。 組織サンプルは液体窒素中で急速冷凍され、-70 °C で保存されました。

CRISPR/Cas9 を使用して、C56BL/6 J マウスで新しい Adamtsl3 変異対立遺伝子が生成されました。 配列 5' CAGCCACCAGGATCCTGTCC 3' (プロトスペーサー隣接モチーフ (PAM) 配列に下線) を持つガイド RNA (gRNA) を、Adamtsl3 遺伝子のエクソン 2 (シグナルペプチド) を標的とするために選択しました (ENSMUST00000173828.2)。 gRNA は、Applied StemCell Inc (米国カリフォルニア州ミルピタス) によって in vitro で転写され、単一の gRNA 分子が生成されました。 PCR増幅された標的領域のサンガー配列決定により、62.5%の活性が示された。 したがって、この gRNA を Cas9 タンパク質とともに C57BL/6 J 胚に注入し、これを代理 CD1 ダムに移し、ゲノム DNA と配列分析を使用した標的領域のその後の PCR 増幅によって分析しました。 サンガー配列で検証された 5 bp 欠失を持ち、変異対立遺伝子の生殖細胞系伝達を伴う創始者マウスを保持し、C57BL/6 J 系統と交雑しました。 WT および L3-KO の耳生検は、WT フォワード プライマー: 5'-GGCTTCCTGGACAGGATCC-3'、または L3-KO フォワード プライマー: 5'-CCCATGGCTTCCTGGATCC-3'、および共通リバース プライマー: 5'-GGGTGTGTTAACAGTGAATCC- を使用して遺伝子型特定されました。 3'、2 つの別々の PCR 反応で、428 bp の PCR 産物が得られました (図 S3a)。 L3-KO心臓におけるAdamtsl3の発現の除去は、LV組織のRNA-seq（図S3b）およびRT-qPCR（図S3c）によって確認されました。

左室後負荷の増加による心臓圧過負荷は、遺伝子型を知らされていない経験豊富なマウス外科医によって、8～11週齢のL3-KOおよびWT雄の同腹子に誘発された。 上行大動脈 (AB) の高精度バンディングは、最近報告されたように、縫合糸ではなく固定内径 (0.55 mm)20 のニトリル O リングを使用した改良された手順を使用して実行され、再現可能な血流制限が得られました。術後の死亡率が低く、心臓の表現型が一貫しています。 マウスは、チャンバー内で４％イソフルランを含む酸素を呼吸することによって麻酔され、ＡＢ手術または偽手術中に挿管され、換気された２％イソフルランを呼吸した。 手術の前後に、0.3 mg/mL ブプレノルフィン (0.1 mg/kg) の皮下注射を行いました。 その後 24 時間にわたって、何らかの痛みの兆候を示した動物に追加の鎮痛薬を投与しました。

心エコー検査は、ベースラインと、AB の 1 週間後、3 週間後、および 6 週間後に実施されました。 動物は４％イソフルランを含むチャンバー内で麻酔され、マスクを通して１〜２％イソフルランを呼吸して麻酔を維持した。 心臓の寸法は、VEVO 2100 イメージング システム (VisualSonics、トロント、カナダ) を使用して、盲検の経験豊富なオペレーターによって取得されました。 心エコー検査画像の分析は、Vevo LAB 超音波分析ソフトウェア (VisualSonics) を使用して、遺伝子型を無視して実行されました。

磁気共鳴画像法 (MRI) は、ベースラインと AB の 1 週間後および 3 週間後に実施されました。 動物は4%イソフルランを含むチャンバー内で麻酔され、麻酔は1〜2%イソフルランで維持された。 収集は、前向きに呼吸ゲート制御され、R ピークがトリガーされました。 検査中は、心電図（ECG）、呼吸数、体温が監視されました。 MRI 取得は、35 mm Rapid QUAD 高周波コイルを備えた 9.4 T 磁石 (Bruker、米国) を使用して実行されました。 1 つの 4 腔長軸 CINE シーケンス スライスと、LV をカバーする短軸スライスのスタックが取得されました。 画像化パラメータは、心エコー検査時間＝１．７ｍｓ（長軸）および２．０５ｍｓ（短軸）、繰り返し時間＝５．０ｍｓ（長軸）および４．７ｍｓ（短軸）、視野＝２５ｍｍ×であった。 25 mm、マトリックス = 128 ピクセル x 128 ピクセル、スライス厚 = 1.0 mm、フリップ角 15°、信号平均化 = 3 回、総取得時間 = 1 ～ 2 分 (長軸) および 6 ～ 10 分 (短軸) ）。 圧縮センシングを使用して、1 つの 4 腔長軸と 1 つの心室中央短軸組織位相マッピング (TPM) 記録を取得しました 38。 TPM パラメータは次のとおりです。心エコー検査時間 = 1.7 ミリ秒、繰り返し時間 = 3.5 ミリ秒、視野 = 25 mm×25 mm、マトリックス = 96×24 ピクセル (4x アンダーサンプリング、再構成後 96×96)、スライス厚 = 1 mm 、フリップ角 = 10°、心拍数に応じて、合計取得時間はスライスごとに約 1.5 ～ 3 分になります。 分析は、前述のように社内の MATLAB スクリプトを使用してブラインドで実行されました 39。

動物は5%イソフルランを含むチャンバー内で麻酔され、深い終末麻酔下でマスクを通して5%イソフルランを呼吸している動物から鼓動する心臓と肺を採取した。 LVを切除し、PBSですすぎ、液体窒素中で急速冷凍し、-70℃で保存しました。

AB 手術または偽手術マウスの心臓を 4% パラホルムアルデヒド (PFA) で固定し、パラフィンに包埋しました。 7 μm パラフィン切片を切断し、RNAscope テクノロジー (Advanced Cell Diagnostics、カタログ番号 465521) による in situ ハイブリダイゼーションを使用して Adamtsl3 mRNA を検出しました。 ハイブリダイゼーションには HybEZ オーブンを使用し、視覚化には 2.5 HD Red 検出キットを使用しました。 組織をヘマトキシリンで対比染色した。 Leica DFC7000T カメラを備えた Olympus BX51 顕微鏡 (Olympus、ペンシルベニア州センターバレー) を、Leica Application Suite v4.6 ソフトウェアによるイメージングに使用しました。

瞬間凍結した LV 組織を 4% PFA で固定し、パラフィンに包埋しました。 Leica RM2255 ミクロトームを使用して、厚さ 7 μm の心室中央切片を Superfrost Plus ガラス スライド (Fisher) 上で採取しました。 次に、これらのスライドをピクロシリウス レッド、ファスト グリーン、およびアルシアン ブルー (RGB) トリクローム染色でよく説明されているように 40 染色し、切片内のコラーゲン タンパク質を視覚化しました。 画像は、Leica DFC7000T カメラおよび Leica Application Suite v4.6 イメージング ソフトウェアを備えた Olympus BX51 正立顕微鏡を使用して取得しました。 色の閾値に基づいて、カスタムの Fiji ImageJ 1.53c (NIH、米国) マクロによって RGB 三色画像からコラーゲンのある領域が自動的に検出され、線維症のパーセントが計算されました。 同じマクロが、両方の時点で両方の遺伝子型のすべての画像に適用されました。

マウス LV 中のヒドロキシプロリンの定量分析（コラーゲンタンパク質含有量の尺度）は、AccQ-Fluor キット（カタログ番号 WAT052880、ウォーターズ、マサチューセッツ州、米国）を備えた高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を使用して、メーカーのプロトコルに従って実施されました。 15 mg の組織を液体窒素中でホモジナイズし、6 M HCl 中で 112 °C で一晩加水分解し、乾燥させ、AccQ-Fluor ホウ酸緩衝液 (Waters) で誘導体化しました。 誘導体は、Ultimate 3000 システム (Nerliens Meszansky、ノルウェー、オスロ) を備えた逆相 HPLC を使用して分離し、ヒドロキシプロリン標準 (Fluka、Buchs SG、スイス) を使用した蛍光検出によって定量しました。

心室中央部の不溶性コラーゲンは、比色ファストグリーン/ピクロシリウスレッドアッセイを使用し、総コラーゲンから可溶性コラーゲンを差し引くことにより測定した。 総コラーゲンは前述のように測定され 41、酵素 Sircol ベースのアッセイ (Biocolor、英国) を使用して可溶性コラーゲンを定量しました 42。 コラーゲン架橋は、不溶性コラーゲンと可溶性コラーゲンの比率として計算されました。 すべての測定は、遺伝子型を知らされていない経験豊富な研究者によって二重に実行されました。 コラーゲンの量は総タンパク質に対して正規化されました。

LV 心筋細胞は、以前に記載されているように WT および L3-KO マウスから単離されました 43。 簡単に説明すると、新たに切除した心臓を定流量ランゲンドルフ装置で大動脈にカニューレ挿入し、(mmol/L で) 130 NaCl、5.4 KCl、25 HEPES、0.5 MgCl2、0.4 NaH2PO4 および 22 グルコース、pH 7.40 を含む分離バッファーで灌流しました。 、37℃。 洗浄後、心臓を、2.0 mg/mL タイプ 2 コラゲナーゼ (290 単位/mg、Worthington Biomedical Corp.、レイクウッド、ニュージャージー州、米国) 溶液で 6 分間灌流することによって消化しました。 LV を解剖し、0.2 mg DNase (Worthington) および 250 μL BSA (40 mg/mL) を加えて撹拌しました。 細胞を200μmメッシュで濾過し、沈降させた。 ペレットを２回洗浄し、Ｃａ２＋レベルを０．２ｍＭまで徐々に増加させた。 単離した CM を倒立顕微鏡 (Observer D1、Zeiss、ドイツ) のチャンバー内にプレーティングし、(mmol/L で) 140 NaCl、5.4 KCl、1.8 CaCl2、0.5 mmol/L を含む Hepes Tyrode 緩衝液 (37 °C) で連続的に灌流しました。 MgCl2、5.0 Hepes、5.5 グルコース、0.4 NaH2PO4、pH 7.40。 記録中、細胞は 1 Hz でペーシングされました。 サルコメアの位置は、63 x/1.2 W 水対物レンズ (対物レンズ C-Apochromat、Zeiss、ドイツ) および高速カメラ (デジタル CMOS カメラ C11440-22CU、浜松、日本) を使用して 2 ms のフレームレートで記録されました。 個々のサルコメア収縮は、Image J (NIH)、Clampfit (Axon Instruments)、およびカスタム Python スクリプトによって分析されました。 簡単に言うと、明視野画像が反転され、FFT (高速フーリエ変換) バンドパス フィルターでフィルター処理されました。 10 ～ 15 個のサルコメアを含む領域が選択されました。 各垂直ピクセルラインの強度を平均し、放物線関数を使用したフィッティング曲線によって Z ライン (ピーク値) の位置を取得しました。 隣接する Z 線の位置を差し引くことにより、単一のサルコメア収縮が得られ、安静時 SL に対して正規化されて短縮率が得られます。 データは、各細胞の 10 ～ 15 個のサルコメアにわたって、および 3 回の連続した収縮にわたって平均されました。

新生仔ラットの初代 CM (nrCM) および CFB (nrCFB) は、以前に記載されているように単離されました 44。 簡単に説明すると、生後1〜3日のウィスターラット(Janvier Labs)の首を切断した後、鼓動する心臓を採取した。 心室を切除し、パンクレアチン/コラゲナーゼ溶液で消化した。 付着細胞集団は、コーティングされていない培養フラスコに 20 分間付着させることにより、非付着細胞から単離されました。 顕微鏡および qPCR 分析によると、これらの細胞は主に CFB でした。 CFB を 1 週間培養した後、6 ウェル プレートに 3.8 × 104 細胞/cm2 で播き、収穫前にさらに 1 週​​間培養しました。 非付着細胞画分、主に CM ですが ECs11 が存在するものを、ゼラチンとフィブロネクチンでコーティングした 6 ウェル プレート上に 3.8 × 104 細胞/cm2 でプレーティングしました。 すべての細胞は、37 ℃、5% CO2 の加湿インキュベーター内で、血清を含むダルベッコ改変イーグル培地 (Gibco) で培養されました。 サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター（L3）下でADAMTSL3（Genbank RefSeq BC128389）をコードする複製欠損ヒトアデノウイルス血清型5（Ad5 dE1/E3）ベクター、またはビヒクル対照（Ad5 dE1/E3）を使用して、ADAMTSL3を新生児ラットCFBで過剰発現させた。 -CMV-Null）（Veh）（両方ともVector Biolabs、PA、USAから市販されている）。 細胞を播種し、4日間の培養プロトコール（図S5a）で24時間後（1日目）に形質導入し、細胞は発達中の未成熟なECMネットワークを堆積させます11。 形質導入は、ウイルス力価 5 × 106 プラーク形成単位 (PFU) で増殖培地中で実行され、感染多重度 (MOI) 100 が得られました。形質導入の 24 時間後に増殖培地を無血清培地に交換しました。 過剰発現の成功は、L3対Veh対照細胞におけるAdamtsl3 mRNAの増加によって検証されました（図S5b）。 IFN-γによる刺激のために、細胞を無血清培地で24時間増殖させ、収集の3時間前に5 ng/mLの組換えIFN-γ（Z03274、GenScript、ニュージャージー州、米国）を添加した。

ヒト胎児心臓線維芽細胞 (hfCFB) は Cell Applications, Inc (カタログ番号 306-05 f) から入手し、心臓線維芽細胞増殖培地 (カタログ番号 316-500、Cell Applications) または線維芽細胞基礎培地 (カタログ番号 115-500、カタログ番号 115-500、Cell Applications) で培養しました。細胞応用）、どちらも 1% ペニシリン/ストレプトマイシンを添加し、37 ℃、5% CO2 加湿インキュベーター内で行います。 特に明記しない限り、細胞は実験のために 10,000 細胞/cm2 でプレーティングされました。 独自の hfCFB 培養プロトコールが使用され、以前に記載されているように、細胞は TGFβ システムの成分を含む成熟 ECM を発達させます 11。 簡単に説明すると、細胞を合計 7 日間培養し、4 日目に L3 または Veh を 5 × 106 PFU で形質導入しました。 24時間後、形質導入培地を無血清基礎培地に変更しました（図S5c）。 過剰発現の成功は、L3対Veh対照細胞におけるADAMTSL3 mRNAの増加によって検証されました（図S5d）。

コラーゲンゲル収縮アッセイは、基本的に記載どおりに実行されました11。 L3 または Veh 形質導入 hfCFB をトリプシン処理し、遠心分離し、無血清培地に再懸濁しました。 細胞を、3 mg/mL ウシコラーゲン I (Bovine PureCol®、Advanced BioMatrix)、2x DMEM (Merck Millipore)、および 0.2 M HEPES (pH 8) を含むコラーゲン溶液と混合し、24 培地に 36.5 × 103 細胞/cm2 でプレーティングしました。 - ウェルプレート、PBS 中の 2% BSA で 37 °C で一晩プレコート。 コラーゲンゲルは 37 °C で 2 時間重合し、無血清培地を添加してゲルを剥離しました。 ゲルの収縮量に相当するゲルの周囲を、６時間後および２４時間後に、ＩｍａｇｅＪ １．５３ｃ（ＮＩＨ）を使用して測定した。

nrCFBを12ウェルプレートに播種し、24時間後にVehまたはL3を形質導入しました。 24 時間後に培地を、50 μM/mL アスコルビン酸および 1 μCi L-[2,3-3H]-プロリン (カタログ番号 NET323001 MC、PerkinElmer, Inc, MA) を含む無血清培地に交換しました。 4日目に、細胞を冷PBSで洗浄し、1M NaOHで溶解し、OptiPhase HiSafe 3液体シンチレーションカクテル(カタログ番号1200.437、PerkinElmer)を使用して希釈しました。 コラーゲンタンパク質生合成の代用として各サンプル中に存在する放射性標識プロリンの量 45 を、Wallac Winspectral 1414 液体シンチレーションカウンター (PerkinElmer) を使用して 1 分あたりのカウント数 (CPM) として測定しました。

L3 または Veh 形質導入 hfCFB を 96 ウェル プレート (カタログ番号 6005430、Perkin Elmer) に 1000 細胞/mm2 で播種しました。 24 時間の血清飢餓後、細胞を 10 μM EdU で 2 時間標識しました。 細胞は Click-iT™ EdU 増殖アッセイ (カタログ番号 C10499、CyQUANT、Invitrogen) を使用して固定され、EdU 蛍光は Hidex Sense Microplate Reader (LabLogic Systems、シェフィールド、英国) で基本的に記載されているとおりに測定されました 11。

RNeasy Mini Kit (カタログ番号 74106、Qiagen Nordic、ノルウェー) を使用して、心臓組織または培養細胞から全 RNA を単離しました。 iScript cDNA 合成キット (カタログ番号 1708891、Bio-Rad Laboratories, Inc.、カリフォルニア州ハーキュリーズ) を、単離された RNA からの逆転写と cDNA 生成に使用しました。 各サンプルの相対的な遺伝子発現は、TaqMan 遺伝子発現アッセイ (表 SIII)、TGFB 経路 (カタログ番号 4414097) およびヒト細胞外マトリックスおよび接着分子 (カタログ番号 4414133) 用の既製の TaqMan 遺伝子発現アレイと、TaqMan Universal PCR Master Mix を使用して決定されました。 (カタログ番号 4304437)。 QuantStudio 3 リアルタイム PCR システム (Applied Biosystems、カリフォルニア州フォスターシティ) を PCR 増幅と検出に使用しました。

RNA配列決定（RNA-seq）は、以前に記載されたのと同様に、AB後1週間にWT（n = 6）およびL3-KO（n = 10）心臓から単離されたLV組織に対して実行されました46。 簡単に言うと、TRI 試薬 (Sigma Aldrich) を使用してフェノール-クロロホルム抽出により全 RNA を単離しました。 ＬＶ組織は、Ｔｉｓｓｕｅｌｙｚｅｒ ＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、１ｍＬのＴＲＩ試薬中で均質化された。 NEBNext® rRNA Depletion Kit (ヒト/マウス/ラット、New England Biolabs) を使用してリボソーム RNA を除去しました。 総鎖 RNA-seq ライブラリーは、CORALL Total RNA-Seq Library Prep Kit (Lexogen) を使用し、精製には AMPure ビーズ (Beckman Coulter) を使用して生成しました。 2100 Bioanalyzer (Agilent) を使用して RNA-seq ライブラリの品質を管理します。 QC と配列決定は、英国ケンブリッジにある Babraham Institute Next Generation Sequencing 施設で実施されました。 RNA-seq ライブラリーは、HiSeq2500-RapidRun 100 bp Single End シーケンスランを使用して、HiSeq2500 (Illumina) の 1 つのレーンでシーケンスされました。 RNA-seq データは、HiSAT247 を使用してハツカネズミ参照ゲノム GRCm38/mm10 とアラインメントされました。 リードは、Trim Galore を使用してアラインメントの前にトリミングされました。ベースコーリングカットオフの Phred 品質スコアは 20 (最大エラーは 100 塩基中 1 に相当し、最大トリミングエラー率は 0.1) でした。 トリミングおよびアライメントされた配列ファイルは、視覚化および分析のために BAM ファイルとして SeqMonk (v1.42.0) にインポートされました。 RNA-seq リードはリードカウント定量化によって定量化し、各ライブラリーの総リードカウントに対してグローバル正規化を実行し、100 万キロベースあたりのリード数 (RPKM) として表しました。 差次的発現遺伝子 (DEG) の分析は、R ベースのソフトウェア DESeq248 を使用して実行されました。 生の (対数変換されていない) 読み取りカウントを入力として使用し、ライブラリーの合計サイズに対してグローバル正規化を実行しました。

マウス Adamtsl3 細胞発現データは、Single Cell Expression Atlas データベース (https://www.ebi.ac.uk/gxa/sc/home)、EMBL-EBI、ケンブリッジシャー、英国、2022 年 5 月 31 日にアクセス) から取得しました。 死亡した臓器提供者の LAA および LV からのヒト ADAMTSL3 発現データは、GTEx プロジェクト ポータル (https://gtexportal.org/home)、Broad Institute (マサチューセッツ州ボストン)、2021 年 5 月 31 日にアクセス) から取得しました。 チャートは、データベースの対話型グラフィック機能から変更されました。

タンパク質は、Triton X-100 (1%)、Tween-20 (0.1%)、プロテアーゼ阻害剤 (cOmplete EDTA-free) を含む PBS ベースの溶解バッファーを使用して、以前に記載されたプロトコール 20,44 に従ってヒトおよびマウスの心臓組織から抽出されました。 Mini、Roche Diagnostics）および PhosStop ホスファターゼ阻害剤（Roche Diagnostics）。 細胞培養物からのタンパク質は、SDS (1%) および Tris-HCl (31.5 mM、pH 6.8) を含む溶解バッファーを使用して抽出されました。 Branson Sonifier® S-150D (Emerson Electric Co. St. Louis、MO) を使用してタンパク質溶解物を超音波処理し、15,000 G で 20 分間遠心分離し、上清を -70 °C で保存しました。 SDS-PAGE およびイムノブロッティングは、Criterion TGX ゲルおよび Trans-Blot Turbo ポリ二フッ化ビニリデン (PVDF) 膜 (Bio-Rad) を Trans-Blot Turbo セミドライブロッティング システム (Bio-Rad) で使用して実行しました。 以下の抗体を使用しました: 抗リン酸 Smad2 (Ser465/467、カタログ番号 3108、Cell Signaling)、抗 Smad2/3 (カタログ番号 3102、8685、Cell Signaling)、両方とも 5% ミルクで 1:1000 に希釈抗 TGFb (Ab92486、Abcam) 1:1000、1% カゼイン、抗 LAP (AF-246、R&D Systems) 1:1000、非還元条件下で 5% ミルク中、抗 LTBP1 (カタログ番号 MAB-388、 R&D Systems)、非還元条件下で 5% ミルクで 1:1000 希釈、抗 α-SMA (カタログ番号 A5228、Sigma) 5% ミルクで 1:10,000 希釈、抗 OPN (Ab181440、Abcam) 1:1000 1% 牛乳、抗 GAPDH (カタログ番号 sc-32233、Santa Cruz Biotechnology) を 5% 牛乳で 1:1000 に希釈、抗 ADAMTSL3 (HPA034773、Atlas Antibodies) を 1% カゼインで 1:1000、および抗 ADAMTSL3 ( -ウサギで産生されたハウスポリクローナル抗体) 1% カゼイン中で 1:1000。 マウスまたはウサギの二次抗体 (1:2000、Santa Cruz Biotechnology) を使用しました。 ECL Prime Western Blotting Detection Reagent (Amersham) を二次抗体検出に使用し、総タンパク質を Revert 700 タンパク質染色 (Licor) を使用して検出しました。 蛍光または化学発光は、Azure 600 ウェスタン ブロット イメージング システム (Azure Biosciences) を使用してイメージングされました。 タンパク質バンドは、ImageJ 1.53c (NIH) を使用して定量化しました。 計算に使用した完全なウェスタンブロット膜は、補足情報の補足ブロットの下に示されています。

統計的な差異は、Prism 8.3.0 (GraphPad) を使用してテストされました。 データは、平均値±平均値の標準誤差 (SEM) で表示されます。 データの分布は Shapiro-Wilk 検定を使用して評価されました。 2 つの正規分布グループを比較する場合、対応のない Student の t 検定が適用されました。 複数のグループを比較する場合、Tukey または Dunnett の多重比較検定を使用した一元配置分散分析が適用されました。 複数の時点の比較には、ガイサー-グリーンハウス補正を備えた二元配置反復測定分散分析を使用しました。 生存曲線の比較のために、ログランク (マンテル-コックス) 検定を実行しました。 P 値 <0.05 は統計的に有意であるとみなされました。 P 値は正確な値として報告されるか、マウス モデル データの場合、有意性は AB 対シャムの *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001、および $p < を表す記号として与えられます。 L3-KO AB 対 WT AB では、0.05、$$p < 0.01、$$$p < 0.001。 RNA-seq データの場合、RPKM 値 ≥1.0 はノイズを上回っているとみなされ、4 つ以上のサンプルで ≥ 1.0 を持つ遺伝子はこのデータセットで検出可能であるとみなされます。 複数のテストに対する Benjamini-Hochberg 補正が使用され、FDR は 0.05 でした。 GO タームおよび KEGG 経路の機能強化分析は、Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery (DAVID) v6.8 分析ウィザード 49 (27.08.21 にアクセス) で実行され、Qiagen の IPA が上流制御因子の予測に使用されました。 すべての細胞培養実験は最低 3 回実施され、これは 3 回の生物学的複製、つまり初代細胞の単離ラウンドまたはヒト胎児 CFB の別々の播種時点を表し、各実験は 2 つ以上の技術的複製で行われました。 in vivo マウス実験は 3 つの別々のコホートで実施されました。 2 つのコホートは 1 週間で採取され、1 つのコホートは 6 週間で採取されました。 各実験の n はそれぞれの図の凡例に示されており、各分析の各グループの n = 3 ～ 12 となります。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

図3のプロットとチャートの生成に使用されたRNA-seqデータは補足データ1にアップロードされ、その全体がヨーロッパヌクレオチドアーカイブ（ENA、EMBL-EBI、ウェルカムゲノムキャンパス、ヒンクストン、ケンブリッジシャー、英国）に寄託されました。 )、アクセッション: PRJEB47017。 主要な図の生成に使用されるすべての数値ソース データは、補足データ 2 にアップロードされます。図の生成に使用される未編集のウェスタン ブロット画像は、補足情報の補足ブロットの下に表示されます。 他のすべてのデータは、合理的な要求に応じて対応著者から入手できます。

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この研究はノルウェー研究評議会によって支援されました。 Anders Jahre の科学促進基金。 南東部地域保健局。 クリスチャン・ゲルハルト・ジェブセン財団。 アーケシュフース大学病院の内部戦略的研究助成金。 ブリックス医学研究促進財団。 オラフ・ラーグホルトとゲルト・マイデル・ラーグホルトの科学基金（ノルウェー）は[IGL]に。 ポール・G・アレン・フロンティアーズ・グループ、マルファン財団、アメリカ心臓協会による[SSA]への支援による、アレン著名調査官プログラム。 オランダ心臓血管研究イニシアチブ (CVON)、RECONNECT コンソーシアム [ELR] からのオランダ心臓財団若手人材プログラム賞。 オランダ心臓血管同盟、CVON She-PREDICTS、2017-21年、Double Dosis、2020-B005、FWO G091018NおよびFWO G0B5930Nを[SH]に助成。 およびカルロス III 保健研究所 (ISCIII) (PI18/01469、PI21/00946 および CB16/11/00483)、欧州地域開発基金が [AG] に共同出資したプロジェクト。 私たちは、実験医学研究研究所のアルミラ・ハシッチ氏とディナ・ベーメン氏、そしてオスロ大学病院のKPMウレヴォール動物施設のスタッフの素晴らしい技術支援に感謝します。

ノルウェー、オスロのオスロ大学病院およびオスロ大学実験医学研究所

キャロライン・B・リプダル、A・オラフ・メルビー、ジア・リー、シェリル・パルメロ、クリスティン・アンドレアッセン、アイヴァル・シャースタッド、タイス・トンネッセン、マティス・K・ストッケ、ウィリアム・E・ルーシュ、ゲイル・クリステンセン、アイダ・G・ルンデ

ノルウェー、ローレンスコグのアーケシュフース大学病院、診断技術部門

キャロライン・B・リプダル＆アイダ・G・ルンデ

KG Jebsen Center for Cardiac Biomarks、オスロ大学、オスロ、ノルウェー

キャロライン・B・リプダル＆アイダ・G・ルンデ

オスロ大学基礎医学研究所分子医学部門（オスロ、ノルウェー）

A. オラフ・メレビー

マーストリヒト大学循環器科、CARIM循環器疾患学校、マーストリヒト、オランダ

エマ・L・ロビンソン & ステファン・ヘイマンズ

米国オハイオ州クリーブランド、クリーブランド・クリニック・ラーナー研究所生物医工学部

デボラ・E・サイフェルト、ダニエル・マーティン、キャトリン・クラーク、スニール・S・アプテ

心血管疾患プログラム、CIMA ナバラ大学および IdiSNA、パンプローナ、スペイン

ベゴーニャ・ロペス & アランチャ・ゴンサレス

CIBERCV、カルロス 3 世保健研究所、マドリード、スペイン

ベゴーニャ・ロペス & アランチャ・ゴンサレス

ノルウェー、オスロ、オスロ大学病院リクショスピタレット心臓病科

クリステン・P・ダール

オスロ大学病院ウレヴォール、オスロ、ノルウェー心臓胸部外科

タイス・トーネッセン

分子血管生物学センター、心臓血管科学部門、ルーヴェン、ベルギー

ステファン・ヘイマンズ

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概念化と研究デザイン: KBR、AOM、SSA、GC、IGL データ収集: KBR、AOM、ELR、BL、CC、JL、DES、DM、SP、KA、CPD、IS、TT、IGL データ分析と解釈: KBR 、AOM、ELR、AG、JL、DM、KA、MKS、WEL、SH、SSA、IGL 原稿ドラフト: KBR、IGL 重要改訂: すべての著者が原稿の最終版を承認し、原稿のあらゆる側面について責任を負うことに同意します。作品。

キャロライン・B・リプダルへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。 主な取り扱い編集者: イブ・ロジャース。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Rypdal、KB、Olav Melleby、A.、Robinson、EL 他。 ADAMTSL3 ノックアウトマウスは、圧力過負荷後に TGFβ シグナル伝達の増加に伴い心機能不全および拡張を発症します。 Commun Biol 5、1392 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s42003-022-04361-1

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受信日: 2022 年 1 月 1 日

受理日: 2022 年 12 月 9 日

公開日: 2022 年 12 月 20 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04361-1

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