手 - ひまわり園グループ

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Rapporti scientifici Volume 12,

Scientific Reports volume 12、記事番号: 10859 (2022) この記事を引用

2521 アクセス

1 引用

4 オルトメトリック

メトリクスの詳細

便の分析は、多くの胃腸（GI）疾患のシンプルで非侵襲的なモニタリングと腸内マイクロバイオームへのアクセスを提供しますが、便を扱うことを嫌う人が蔓延しているため、便サンプリングプロトコルを順守することは依然として大きな課題です。私たちは、便タンパク質と分子分析のためにトイレ廃水から個々の便検体を収集することを可能にする技術を紹介します。人間の便標本と市販のトイレに統合されたベンチトップ試験プラットフォームを使用して、固体/液体の分離とそれに続く噴霧浸食によって、広範囲の便濃度にわたって信頼性の高い検体収集が実証されました。得られた糞便懸濁液を使用して、消化管癌スクリーニングおよびマイクロバイオーム 16S rRNA 分析のための潜血検査を実施しました。潜血家庭用検査キットを使用したところ、標準サンプリングと全体で 90% 一致し、感度が 96%、特異度が 86% であることがわかりました。マイクロバイオーム分析の結果、標準サンプリングと比較してサンプル内の種の多様性に有意な差はなく、サンプルの相互汚染はアッセイの検出限界を下回っていたことが明らかになりました。さらに、下痢の追跡のためにリアルタイムで軟便を評価するためのアナログ濁度センサーの使用について報告します。この技術を住宅環境に導入すると、日常的な便モニタリングの順守が促進され、消化器医療の質が向上します。

スマートフォン、ウェアラブル、家庭用センサーによって行われる非侵襲的な個人の健康モニタリングには、客観的でより頻繁なデータ収集、遠隔モニタリングの利便性という利点があり、このデータを病気の進行と治療反応の有意義な臨床評価に統合することが期待されています1,2。機能性胃腸疾患、自己免疫疾患、結腸直腸がんなど、広く蔓延している症状に対する胃腸（GI）医学における遠隔健康モニタリングへの関心が高まっています3,4。これらの症状は、世界中で 10 人に 1 人もの人が罹患していると推定されており、生活の質、労働能力、医療費に重大な影響を与えています5、6、7、8。

従来あまり利用されていなかった便は、非侵襲的かつ縦断的に収集できるため、遠隔消化管疾患モニタリングにとって魅力的な生物学的標本です。結腸内視鏡検査よりも侵襲性が低く、費用もかからない便ベースの生化学分析により、消化器がん9,10、クロストリジウム・ディフィシルなどの腸管感染症11、炎症性腸疾患の治療に対する反応12,13、グルテン消費など、多くの急性および慢性の消化器疾患の検出が可能になります。セリアック病患者による14．疾患の診断に加えて、分子分析および配列決定と組み合わせた糞便検体へのアクセスにより、腸内マイクロバイオームの分析が可能になり、疾患の病因の新たな理解と、多くの腸内および腸外の状態における新たな治療アプローチの追求が可能になります15。 16、17、18。微生物叢の組成を時間的に高密度で分析することにより、食習慣、薬物治療、腸の運動性などの環境要因から病態生理の影響を識別する能力が得られる可能性があります19。

非侵襲的で効果的であるにもかかわらず、便ベースの分析の実施は実際には大幅に制限されています。患者が臨床診察中に便検体を採取できることはほとんどありません20、22、23、24、25、26、27、および多くの研究さまざまな地域の人々は、定期的な便検査に基づく消化器疾患監視の摂取量と遵守率が低いことがわかっています20、21、22、23、24。糞便検査による監視の障壁を調査した研究では、糞便検査よりも血液検査の方が好ましいことが判明し、活動性疾患を有する患者のみが糞便検査に従う可能性が高いことが示唆されています20,25。患者の状態が安定しているときに実施された監視研究では、一貫して、4 回以上の反復糞便検査の遵守率はわずか 30% でした 21、22、26。調査研究によると、糞便検査を繰り返し行う際の遵守度が低い主な理由は回避/物忘れであり 27,28、回答者の 60% 以上が糞便検査の受け入れ性が低い理由は採便時の嫌悪感/恥ずかしさであると述べている 23,25,29。

最近、便ベースのデータをより有効活用し、便分析と日常的なトイレの使用を統合するアプローチが提案されています 30,31。トイレ内およびトイレ周囲の排泄物モニタリングに関する学界およびトイレ製造業者による新たな取り組みは、尿の分析に焦点を当てている31、32、33、34、35、36、37。

糞便標本へのアクセスは、材料の非常に粘着性の高い性質とその不均一性のため、技術的に困難です 38,39。便の外観特徴を追跡するために、ユーザーによる 40 または便座上のカメラによるユーザーの介入なし 31 による便器内の大便の画像キャプチャが提案されています。これは、患者の評価と便の粘稠度などの特性との間に重大な差異が報告されているためです。下痢の場合41、42、43。しかし、バスルーム、特に便座でのカメラの操作には、大きな社会的タブーとプライバシー上の懸念があります。

ここでは、サンプルの収集と分析のために特別に設計された水洗トイレのすぐ下流で人間の糞便を隔離するアプローチについて報告します。廃水は、ポリオ 44 の地域レベルでの感染症の分子分析に基づく監視に長年使用されてきました。また、2020 年以降、廃水は、地域での新型コロナウイルス感染症の蔓延を評価するための SARS-CoV-2 の検出に広く使用されています。コミュニティレベル45、46、47、48、49、50、51。私たちのアプローチでは、廃水ベースの分析の分解能を 1 つのトイレとそこに流される個々の便のレベルまで向上させることを目指しました。この技術の目的は、便サンプリングのプロセスを自動化して日常業務とシームレスにし、検査計画の順守を改善し、より優れた疾患管理と転帰の改善を可能にすることです。

この研究では、継続的な健康状態のモニタリングのためのハンズフリーの人間の便収集の概念実証デモンストレーションを示します。このアプローチでは、分析目的でトイレを流した後、大便と廃水が分離されます。緩衝スプレー侵食に基づく方法は、自動化が容易で相互汚染の問題を管理できる方法で、生化学分析のために便の一部を収集するために使用されます。潜血測定と 16S rRNA マイクロバイオーム分析という 2 種類の生理学的に関連するデータが、プロトタイプシステムから得られた糞便検体に対して実施されました。結果の分析的完全性は、従来の方法でサンプリングされた便検体と対で比較することによって評価されました。臨床的に関連のある水様便と軟便の場合、下痢を追跡するために軟便と他のタイプの廃水を区別する機能を備えたインラインアナログ濁度センサーを実証します。

私たちのアプローチの基本的な設計基準は、ユーザーにアクションや習慣の変更を要求したり、不快感を引き起こしたりすることなく、便の分析をトイレの日常的な使用とシームレスに統合することです。この基準により、導入に対する障壁が最小限に抑えられ、長期的なデータ収集の可能性が高まります。私たちは、便器の外観と機能を変更せず、検体が便器から出た後、ユーザーの権限外でサンプリングと分析が行われる配管内で操作することによって、この目的を達成しました。

もう 1 つの重要な要件は、トイレの使用者から独立し、自動化に適した方法で便をサンプリングできることです。

健康監視ツールとして価値があるためには、システムが便秘から軟便に至る臨床範囲全体の便の硬さを検出できなければなりません。成人の便をその外観に基づいて分類するために広く使用されている標準的な医療診断ツールは、Bristol Stool Form Scale (BSFS)38,39 であり、BSFS 1 (ナッツのような個別の硬い塊) から BSFS 7 (水っぽく、固形物はありません）。

標準的な水洗トイレは、人間の排泄物を処理するボウルで構成されており、水を使用して排水管を通して別の場所に流し、廃棄します。この設計で重要なのは、水を保持する出口パイプの U 字型部分 (P トラップまたは S トラップと呼ばれます) であり、シールとして機能し、有毒ガスがトイレを通ってバスルームに上昇するのを防ぎます。当社の設計では、トラップ後のトイレ出口の配管に組み込まれた装置を使用して糞便を捕捉し（図1）、トイレの臭気封止特性を維持します。便全体の可逆的な固定化は固体/液体の分離によって達成され、ベンチトップのテストベッドに便を流すことによって実証されました (図 1A ～ C)。固定化は、流動輸送力とゲートバルブ V1 による閉塞の組み合わせを使用して達成されました (図 1D)。 V1 が閉じられると、慣性によって固形廃棄物が V1 によって閉塞された 3D プリントされたカスタム設計コンポーネントに輸送されました。水はバルブ V2 と分流パイプにあるバルブ V3 を通って排水されます。便は弁 V2 の近くで固定されており、通常は閉塞している弁 V1 とは接触していませんでした。水の大部分はバルブ V3 を介して排出され、通常の洗浄と同様の速度でボウルが空になることが保証されました。どちらのタイプのトイレでも、テストの 90% 以上 (図 2A) で便がバルブ V2 付近の領域で固定されており、サンプリングポートと位置合わせされていることがわかりました (後部出口のトイレでは 90 回、下側の出口では 40 回洗浄)トイレ）; 残りのケースでは、便は通常、バルブ V2 とバルブ V1 の間に固定されていました。便が固定され、水が排出されたら、防水検査カメラ (6 個の LED 照明を備えた Depstech 内視鏡) を使用してポートを通して便画像を収集しました (図 2B)。研究者の一部が以前に報告したように、個々の便のこのような画像は、機械学習による便の形態の正確な決定に非常に適しています52。

(A) 後部出口トイレに接続されたプロトタイプの図。 (B) (A) に示したプロトタイプの底部の拡大図。 (C) 画像収集のためにラップトップに接続された内視鏡を備えた下出口トイレに接続されたプロトタイプの写真。 (D) 4 つのバルブ、V1 ～ V4、および I = 検査および通気ポートを含むシステムの動作原理。 1. トイレの通常動作時のバルブ位置。青い矢印はトイレから下水道への水を流す方向を示します。 2. 便は便エリア (赤い破線の長方形) で固定されます。 3. バッファーのスプレージェットが、V4 を介して重力によって収集された標本を侵食します。 4. 大便は下水道に流されます。

(A) 後部出口および下側出口のトイレで形成された代理動物および人間の便を使用して測定された固定化効率。 (B) プロトタイプ内の固定化された人間の便の現場画像。 (C) 噴霧侵食により抽出された糞便標本の画像。 (D) 1 回のトイレ洗浄による固定領域からの便除去効率。 (E) 検体抽出時および便が除去され定置洗浄手順が実施された後の、異なる濃度 (BSFS タイプ) の便検体の最確数 (MPN) による細菌の計数。

高圧液体流を使用して標本を抽出し、固定化された便の一部を浸食および溶解しました（図 2C）。緩衝液で浸食された液体試料は、ゼロデッドレッグバルブ V4 を介して重力によって収集されました (詳細は「試料の抽出」セクションを参照) (図 1D、ステップ 3)。

手術の最終段階として、バルブ V1 の閉塞を除去し、他のすべてのバルブを閉じた状態で、便の残りを 2 回目の洗浄によって下水道に廃棄しました。テストの 90 ～ 100% で 1 回のフラッシュで除去が達成されました (図 2D)。

糞便などの粘着性物質をサンプリングする際の主な関心事は、標本間の相互汚染を最小限に抑えることです。当社の設計には、停滞した容積や突出する表面を排除する目的で、ゼロデッドボリュームサンプリングバルブが含まれていました。また、トイレの表面をすすぐために水道水を利用しました。便固定化時の検体間の汚染の程度を調べるために、便中に自然に存在する糞便性大腸菌群を測定しました。

糞便細菌は、3D プリントされた ABS デバイスからのサンプルに対して最確数 (MPN) 法を使用して定量化されました。 MPN アッセイは、抽出された便標本と、大便処理後のブランクフラッシュからのサンプルに対して実施されました。予想どおり、検体サンプル中の細菌濃度は高かった (> 104 MPN/mL) (図 2E)。廃棄フラッシュ後に収集されたサンプルには、細菌含有量が 1 から 3 log 減少と大幅に減少しましたが、これはおそらくサンプルがどの程度「きれい」に除去されたかに関係していると考えられます。この研究における定置洗浄手順は、2 回目のフラッシュで構成されていました。さまざまな濃度の検体 [BSFS 3 (ソーセージ形状) から BSFS 6 (どろどろした) までの値] をテストしました。これらのテストでは、このフラッシングは抽出量に対して適切で、結果として細菌含有量がアッセイの検出限界 (3) を下回りました。 MPN/mL)。

糞便アッセイのための標準的なサンプリングでは、人間が溝付きの棒またはスパチュラを便の複数の領域に挿入し、すぐに検体を緩衝液で希釈する必要があります (図 3)。相互汚染を避けるために測定ごとに新しいスティックが必要となるため、このプロセスは廃水配管環境内で自動化することが困難です。

標本のサンプリング研究。標準サンプリング: (A) メーカーからの手順図。 (B) 中央値 8 mg/mL の総湿潤固体の分布。 (C) 個々の試料からの全固形分の平均および標準偏差、各試料の n = 3 ～ 5。 BS2 = Bristol Stool Form Scale 2 は、塊状で硬い粘稠度の便を示します。プロトタイプのサンプリング (D): 概略図。 (E) プロトタイプから収集された総湿潤固体の分布。 (F) 示された圧力で 5 秒の噴霧時間を使用して個々の標本から抽出された総固形分。

私たちは、配管や自動化に容易に適用でき、糞便の特定の特性に基づいた新しいサンプリング手法を提案します。形成された糞便の水分含量は平均 75%53 であり、これは一般的なペースト状物質とは対照的に高いです。たとえば、これらの試験で使用された大豆代替品の水分含量は 54% と測定されましたが、下痢の場合の水様便の平均水分含量は 88% です54。便の水分含量が高いことは、固形便を操作しやすく粘着性の少ない液体に変えるには、少量の液体を添加するだけで十分であることを示唆しています。

私たちの設計における糞便検体の抽出は、便を侵食するための緩衝剤のスプレージェットと、バルブ付き開口部を通した重力による液化サンプルの収集に依存していました。このアプローチの利点は複数あります。パイプ内に機械部品がなく、(スプレーとバルブの) 自動化が容易で、洗浄が容易です。ほとんどの糞便アッセイでは緩衝液での希釈が最初のステップであるため、このアプローチにより生化学分析に適した標本が得られると考えました。

糞便アッセイには少量の便（約 10 分の 1 mg）が必要であり、多くの場合、一定範囲の値に耐えることができます。湿った全固形分含有量 (mg/mL) は、緩衝液中の固形分量の希釈の尺度です。便中の病原体を検出するための分子検査では、20～100 mg/mL の湿潤固体が得られる 50～200 mg の質量（SI を参照）が推奨されますが、マイクロバイオームのようなより豊富な種の検査では、曖昧な「少量」の便が必要です。ポイントオブケア（POC）アッセイの便量を決定するために、市販の在宅潜血検査でスティックによって収集された固形物の量を測定しました（図3A）。図 3B は、18 便にわたる標準サンプリングを使用して得られた固形分の結果を示しており、中央値 8 mg/mL、平均 11 mg/mL、標準偏差 12 mg/mL という広範囲の値を示しています。便の形態の不均一性 (BSFS 2 ～ 6 が測定された) は、この変動性の一部を説明します。ただし、図 3C は、同じ便検体に対する反復測定の結果、大きなばらつきが生じたことを示しています (CoV は 0.2 ～ 0.7)。私たちが提案する抽出アプローチ (図 3D) のパフォーマンスは、流量調整可能なポンプと精密ノズルに接続されたカスタムセットアップを使用して評価されました。

スプレー侵食によって抽出される固体の量を調査しました。測定は、複数の流量 (0.4 ～ 1.1 L/min、ノズル仕様によると、3.6 ～ 30 psi の圧力に相当) および異なるスプレー時間 (2 秒、5 秒、10 秒) で実施されました。噴霧侵食された標本をバイアルに収集し、方法で説明したように乾燥して総固形分を測定しました。

図 3E は、スプレー侵食により、数 mg/mL から 60 mg/mL までの広範囲の湿潤固体を収集できることを示しています。ヒストグラムは、異なる流量とスプレー時間を使用することにより、標準サンプリングの範囲を完全にカバーする広い範囲を示しています。。このアプローチにより硬い便 (BSFS 2) から適切な糞便検体溶液を収集できることを確認するために、10 psi で標準方法と同等の 2 ～ 5 mg/mL の値が生成されることを示しました。 30 psi に増加すると、20 mg/mL を超える固体が得られました。この研究には硬い塊の BSFS 1 便は利用できませんでしたが、このデータと圧力を上げる能力は、スプレー侵食を調整して便の粘稠度の全範囲から標本を取得できることを示唆しています。軟便の場合、標準サンプリングで得られる中央値 8 mg/mL に匹敵する 10 ～ 20 mg/mL の範囲を得るには、3.6 psi の圧力が最適でした (図 3F)。

スプレー侵食を使用したプロトタイプから得られた便検体から消化器疾患タンパク質バイオマーカーを測定する実現可能性を実証するために、潜血を測定するための十分に確立されたラテラルフローアッセイ（LFA）糞便免疫化学検査（FIT）を選択しました。潜血の糞便免疫化学検査 (FIT) はヒトのヘモグロビンの検出に依存しており、食物や薬剤の摂取制限は必要ありません。 FIT 検査は、消化管がんに対する感度が高く、特異度が優れていることが特徴であり 55、定期的に消化管がんのリスクがある 45 歳以上の人々を対象とした年次スクリーニングとして世界中で推奨されており、米国癌協会によっても推奨されています 9、10、56。

健康な便は潜血陰性であり、これらのキットの能力テストで行われているように、ヒトヘモグロビンを添加すると陽性の測定値が得られます57。家庭用の FDA CLIA ウェーブ FIT 側方流動アッセイキットが数多く用意されており、定性 (陽性/陰性) 出力が得られます。私たちの調査では、Pinnacle と Accutest57 というブランドを評価しました。どちらのテストも、サンプリングキットと、読み取り用のイムノクロマトグラフィーストリップを備えたカートリッジを備えています (図 4A)。サンプリングキットは小さなバイアルで、数 mL の緩衝液 (ピナクルの場合は 3 mL、アキュテストの場合は 2.5 mL) が入っており、便採取用の溝付きプラスチックスティックにキャップが取り付けられています。溝付きスティックを所定回数（６回）便に挿入した後、溝付きスティックをバイアルに戻し、振って便を緩衝液に溶解させる。キットバイアルには、規定数の便液をカートリッジに滴下するための小さなキャップが付いています。溶液の適用から 5 分以内に、カートリッジのコントロールラインが表示され、ヘモグロビン (Hb) の存在下ではテストラインの色が表示されます (補足図 S1)。

在宅潜血検査に対する標準サンプルとプロトタイプのサンプリングの影響。 (A) バッファー付きチューブ、サンプル収集用のネジキャップと溝付きスティック、結果を読み取るためのカートリッジを含む、家庭用キット (ピナクル) の写真。 (B、C) さまざまなヘモグロビン (Hb) 濃度でスパイクされたヒト便に対する (B) Pinnacle ブランドと (C) Accutest ブランドの陽性率 (陽性検査の割合)。黒い矢印: テストの公称検出限界。 2 番目の横軸の数字は反復回数です。 (D) カットオフ (Pinnacle ブランドの場合は 10 ng/mg、Accutest の場合は 75 ng/mL) を超える Hb 濃度での同じ検体のペアワイズ比較の一致行列。

Hb の検出限界はメーカーによって設定されており、通常は 50 ng/mL です。便 1 mg あたりの Hb ng として表される Hb 検出限界は、ピナクルでは 6 ng/mg、アキュテストでは 50 ng/mg と報告されています。

公称閾値以上の範囲にわたる Hb スパイク濃度の範囲をテストすることにより、キットの公称感度を比較しました。侵食用の緩衝液として PBS を使用し、湿潤固形分含有量が 5 ～ 25 mg/mL の範囲のスプレー侵食標本を取得し、滴と同等の体積（75 μL）をカートリッジに適用しました（補足図 S1）。図 4B は、10 ng/mg Hb で 100% の陽性読み取り値 (n = 18) を示す標準サンプリングの感度曲線を示しています。これは公称感度カットオフを超える値であり、スパイクされていない検体では 4% (n = 26) が陽性でした。プロトタイプからのカートリッジサンプルの測定値も同様で、検出限界を超える 100% の陽性測定値と、スパイクされていない試料の 7% の陽性測定値でした。プロトタイプのサンプリングが標準サンプリングと同じ分析検出濃度を達成したというケースを強化するために、100 μL の懸濁液を使用した Accutest アッセイでも同様の研究が行われました (図 4C)。

標準法と比較してプロトタイプサンプリングによって得られた検査結果の感度、特異性、および完全な一致を判断するために、固定 Hb スパイク濃度で同じ検体についてサンプリング法のペアワイズ比較を実施しました。 Pinnacle アッセイでは、感度は 95%、特異度は 83%、43 ペアのうち合計 38 ペア (88%) が一致しました (図 S2)。不一致のテストペアは主に、プロトタイプのサンプリングが陽性であったのに対し、標準が陰性であったことが原因でした。これは通常、固形分濃度が高いことが原因でした (2 つのケースでは 60 mg/mL)。 Accutest アッセイ (図 S3) では、20 ペア中 19 ペアが一致しました (95%)。全体として、感度 96%、特異度 86% と 90% の一致が見られました (図 4D)。

ピナクルアッセイを使用して、トイレットペーパー (スプレー浸食中に大便を覆う) や尿 (便器を模倣した希釈尿に 60 秒間浸した大便) などの干渉物質がアッセイのパフォーマンスに影響を及ぼさないことを示唆する概念実証データも収集しました。侵食する）。トイレットペーパーと尿の両方について、各条件における n = 5 のテストについて、真実との 100% の一致 (スパイク/非スパイク便のそれぞれの陽性/陰性の結果として定義) を測定しました。

この実験の目的は、システムから収集された検体に対するマイクロバイオーム分析の実現可能性を実証することでした。標準的な処理のために、便の標本を採取し、スパチュラでサンプリングしました。次に、同じ便を便器に置き、水を流し、スプレー侵食によってサンプルを収集しました。この研究では、S1、S2、S3、S4 の 4 つの便を使用しました。 S4 便を便器に置いた場合、尿による汚染の可能性を調査するために、流す前に 1 分間 500 mL の尿も加えました。これにより、検体を S4u と呼びます。両方のサンプリング手法について、S1 は 6 つの生物学的反復で測定し、S2、S3、S4u は 3 回反復して測定しました。さらに 6 つの S1 複製を遠心分離し、濃縮されたスラッジを分析に使用しました。合計 n = 36 のサンプルが 16S rRNA マイクロバイオーム分析を受けました。

便サンプリングポータルから抽出された DNA 濃度は豊富であり (従来のサンプルの 269 ng/μL と比較して 64 ng/μL)、16S リボソーム RNA 遺伝子の配列決定には十分以上であることがわかりました。提出された 36 個のサンプルはすべて、分析の最低基準を満たしていました。目別の細菌分類群の相対存在量の分析では、健康な被験者で予想されるように、クロストリジウム目とバクテロイダル目が 1 番目と 2 番目に多いことが示されました 58 (補足図 S4)。

標準サンプリングと設計サンプリングのサンプル内の微生物の多様性 (α 多様性)、およびサンプル間、つまりサンプリング手法間の差異 (β 多様性) を定量化しました。

サンプル内の種の多様性（α多様性、シャノン多様性指数）は、サンプリングアプローチ全体で大幅に変化しませんでした（図5A）。アルファ多様性分析は、固定効果としてサンプリングアプローチ、ランダム効果として便を使用した線形混合効果モデルを使用して実行されました。 p 値は有意ではなく、尿で洗い流された標本である S4u も含まれていました。

便 S1、S2、S3、および s4u からの n = 36 の糞便検体のマイクロバイオーム分析結果。 (A) 便およびサンプリング手法によるサンプル内の微生物種の多様性 (アルファ多様性、シャノン指数)。 * は核酸抽出前に遠心分離されたサンプルを示します。 (B) 分類学的距離を示すベータ多様性インデックスを使用した階層的クラスタリング: クラスタリングはサンプリングアプローチの周囲ではなく、スツールの周囲にあります。 (C) 対象の試験グループのサンプリング方法 (標準 vs プロトタイプ) を比較するベータ多様性メトリクスのパーマノバ解析からの P 値: すべての便サンプル (便の対照)、便 1 および便 4u。 P < 0.05 は統計的に異なります。

ベータ多様性は、複数の測定基準（つまり、Bray-Curtis、Jaccard、UniFrac、および加重非正規化 UniFrac）の標本ペアごとに計算されました。階層的クラスタリングは、ベータ多様性メトリクスを使用して実行されました。図5BのBray Curtisベータ多様性指数の樹形図は、サンプリングアプローチではなく標本の周りにデータがクラスタリングしていることを示しています。これらのデータは、健康な人のマイクロバイオームの既知の特徴であるマイクロバイオームの個人間変動が、サンプリング手法よりも大きな要因であることを示しています。

ベータ多様性の順列多変量分散分析 (Permanova) を使用して、2 つのサンプリング手法を比較し、帰無仮説を検定しました。

結果は測定基準と便に応じて混合され（図 5C）、p = 0.05 未満の p 値が有意であると見なされ、サンプリングアプローチによって導入された違いを示しています。異なる種類の緩衝液での保存は糞便マイクロバイオームのプロファイルに影響を与えることが報告されているため、噴霧浸食サンプリングで使用される緩衝液の種類が影響を与える可能性があると我々は考えています60。興味深いことに、便 S4u では、パーマノバ分析では 4 つの指標すべてが p = 0.1 以上という結果になり、尿汚染が限定的な懸念であるという仮説が裏付けられています。私たちの設計では、便収集キットで収集された尿汚染検体とは対照的に、尿と便の接触時間は時間的に制限されています。

固液分離による便採取法は、幅広い便濃度に適しています。 1 つの制限は、完全に水っぽい便 (BSFS 7) には利用できないことです。しかし、いくつかの生理学的状態は軟便または水っぽい便を引き起こし、そのような便の発生自体が重要な消化管バイオマーカーです。具体的には、下痢は臨床的には 24 時間に 3 回の軟便の排出と定義されます。従来の診療では、この診断は一般に自己申告に依存しているため、治療に影響を与える精度が限られています。ここでは、トイレの排水配管に沿ったアナログセンサーに依存し、図1で説明した構成と互換性のある、下痢を監視するための非侵襲的な方法を提案します。

私たちは、溶液中の浮遊粒子の光散乱に基づく測定である比濁濁度が、水溶液中の溶解便の存在の高感度な測定値であることを発見しました。バッチ静的 (流れなし) テストでは、方法で説明したように、1 回のトイレ使用をエミュレートする濃度で水、人間の尿、および大便 (形成されたものと液体の両方) を混合しました。水中で形成された便の濁度値は 10 ～ 120 FNU (ホルマジン比濁単位) の範囲であり、水のベースライン (T = 0.7 FNU) や水に加えた尿 (T = 1.1 ± 0.3 FNU、n = 5) とは大きく異なりました。便は水に完全に溶解し、BSFS 7の水様便をエミュレートし、濁度測定値が1000 FNUを超える飽和をもたらしました（図6A）。

(A) t = 1 分の浸漬後に測定された、BSFS によって定義されたさまざまな形態の便を含む溶液からの静的濁度計の測定値。 (B) 水のみ、尿および形成された大便について、トイレの水洗時 (t = 30 秒) で記録されたセンサー出力。 (C) ピークに対応する所定の時間にフラッシュされた溶解検体について記録されたセンサー出力 (明確にするために、曲線は縦軸と横軸の両方でシフトされています)。 (D) 試料タイプ別のセンサー出力の曲線下面積のクラスタープロット。明確にするためにデータポイントは間隔をあけて配置されています。点線は、溶解した検体を他のタイプの廃水から分離する 2 V の提案された閾値を表します。

家電製品の水の濁りを監視するために設計された防水アナログ濁度センサー (SEN0189) を使用して、廃水配管内の濁度を動的に測定しました。センサーは Hach 2100Q 濁度計 (補足図 S5) に対して校正され、湿った固形分が 30 mg/mL まで直線的であり、トイレ廃水中の下痢を検出するには十分すぎることがわかりました。トイレットペーパーが濁度センサーに及ぼす影響は無視できることが判明しました。セラミック配管器具に関する ASME 規格 112.19.2 (「方法」) に準拠した量のトイレットペーパーを使用して、異なる濃度の便代用物 (大豆ペースト) および/または異なる条件 (撹拌または静置) で一対の測定を実行しました。トイレットペーパーを追加した場合と追加しない場合。トイレットペーパーでは、測定値に有意な差は生じませんでした（トイレットペーパーありとなしのn = 12対の測定でp = 0.7334）。トイレットペーパーの崩壊時間は10分から数時間の範囲であり61、空間内の広範な乱流によって促進されるため、これは驚くべきことではありませんでした。下水道システム、トイレから出る小さなパイプをはるかに超えたところにある62。

トイレ洗浄時の動的応答を評価するために、後部出口トイレのベンチトップセットアップに濁度プローブを設置しました。プローブはSトラップの水に浸された排水パイプに設置され、電子アダプターはパイプの外側にありました（補足図S6）。センサープローブの出力は、次のプロトコルで収集されました。60 秒の記録、t = 10 秒で便または尿がボウルに注がれ、t = 30 秒でトイレが流されました。図 6B は、水と形成された便の典型的な読み取り値を示しています。フラッシュによって生じる乱流により、フラッシュ中に短いノイズスパイクが発生する可能性がありますが、それ以外の場合、出力は変化しません。溶解した糞便または代理動物のいずれかの濁った溶液のフラッシュにより、t = 30 秒で数秒幅のピークの兆候が生成されました (図 6C)。場合によっては、水を流す前にボウルに溶解検体を注ぐと、濁度センサー信号が発生し（図 6C の上の曲線）、溶解検体が S トラップを通過してトイレで流すことなくセンサーに到達したことを示しました。フラッシュの周囲で測定されたすべての信号について測定された曲線下面積が図 6D にプロットされています。水、尿、形成された便の値はゼロまたは 2 V 未満です。溶解した検体について測定された値は 2 V を超えており、AUC 測定基準が軟便の存在を識別するためのしきい値として使用できることを示しています。

自分自身の便を扱うことへの嫌悪感は、おそらくこの生理学的標本からの健康データを利用する際の最も大きな障壁となっています 23,25,29。この研究は、トイレ排水からの便収集の実現可能性と生化学分析のための標本の適合性を実証しました。

トイレ関連の便分析に関する以前に発表された研究では、便の画像化に便器または便座のセンサーまたは容器が使用されており、生体分子アッセイの診断特異性は達成されていませんでした 31,34。我々は、排水配管の特定領域における大便検体の固液分離と、スプレー侵食による大便サンプリングを達成する構成を報告する。この構成は、汚損や故障の可能性がある下水道管内の機械部品を最小限に抑え、相互汚染を引き起こす可能性のある試験片の機械的汚れを引き起こさず、自動制御に適しているため、有利です。

ユーザーの権限外で従来のトイレを使用した後に行われるこの便サンプリング手法は、便検体の収集に対する大きな障壁を取り除くことになります。私たちは、腸の健康と病気を長期的にモニタリングするために、家庭に便サンプリングシステムを設置することを想定しています。便分析は、診断された慢性疾患に適切なバイオマーカーを測定する POC デバイスによって現場で、または健康スクリーニングや研究目的で検査室分析によって実施できます。

我々は、消化器がんのスクリーニングのための確立された潜血用の臨床POCキットを使用して、採取された糞便検体の分析的完全性を実証しました。私たちは、このアプローチを、頻繁なモニタリングによって臨床転帰を改善できる追加の便バイオマーカーに適用できると考えています。たとえば、このアプローチは、炎症性腸疾患の治療決定において広く使用されている糞便カルプロテクチンの測定に使用できる可能性があります63。便ベースの POC アッセイは、グルテンフリーの食事中のセリアック病患者における不注意なグルテン曝露を検出するためにも使用できます 14。

この研究のサンプリング手法により、マイクロバイオーム分析に適した標本が得られました。サンプルの数は限られていますが、我々のデータは、16S rRNA マイクロバイオーム分析が噴霧浸食サンプルで容易に実行できること、および廃水中の尿と便の混合が測定可能な影響を引き起こすとは思われないことを示唆しています。緩衝液の選択を最適化し、研究室に輸送する液化検体の自動シールを実装するには、さらなる研究が必要です。

分子分析に基づく糞便病原体スクリーニングの場合と同様に、この研究で使用された 2 つのアッセイは、分析される糞便の正確な量に依存しないことに注意してください。今後の研究では、噴霧浸食された糞便標本を遠心分離して得られた固体ペレットを分析することにより、代謝物分析などの定量的な糞便アッセイの実現可能性を検討する予定です。

また、廃水中の軟便に対するリアルタイムセンシングアプローチも実証しました。下痢を適切に診断し治療するには、長期にわたる軟便/水様便の発生が臨床的に重要です。便の視覚的評価はトイレ使用後に容易に実施できるという事実にも関わらず、排便の追跡は負担がかかり、不正確になりがちであり、特に過敏性腸症候群などの一般的で慢性的な状態では、治療介入が遅れたり、効果が低下したりする可能性があります43。

この研究は実現可能性を実証するものであり、いくつかの制限があります。テストシステムはトイレの 2 倍の大きさで、標準的なバスルームの設置面積内には収まりませんでした (建築基準法に基づく床排水口と壁の間の距離は 12 インチ)。継続的なエンジニアリングの取り組みは、インフラストラクチャを変更せずにバスルームに設置できるようにシステムをよりコンパクトにすることと、フローバルブの操作の自動化に焦点を当てています。この研究はまた、トイレシステムの外で収集された健康な人間の便の使用に限定されていました。今後の研究では、このシステムを使用して臨床検体と人間の被験者を対象としたアプローチを実証する予定です。西側世界におけるトイレ使用の主要な要素であるトイレットペーパーは、この研究では体系的に評価されていませんでしたが、予備データは、トイレットペーパーがPOCテストと濁度測定の結果に影響を与えないことを示唆しています。

この技術を家庭用監視システムとして最終的に実装する場合、このシステムは特殊な材料や高性能の作動を必要とせず、基本的にパイプの形状と市販のバルブを利用して水流を調整するため、コストが手頃になることが予想されます。既存の水槽フラッシュから。私たちは、現在のトイレ価格の中程度の価格で、最終的には医療保険で購入がカバーされるシステムを構想しています。

結論として、本発明者らは、生化学的アッセイのためにトイレ廃水から個々の便検体を収集できるようにする構成を提示した。ここで提示されたデータは、腸の健康と病気をより高水準でモニタリングするためのシームレスな便バイオマーカーデータ収集を達成するアプローチのさらなる開発を裏付けています。

糞便と尿のサンプルは、デューク大学保健システム IRB 0010-5536 によって承認されたプロトコールに従って、健康な匿名のボランティアから収集されました。すべての研究手順は、ヘルシンキおよびデューク大学の宣言および関連する規制および手順に従って実施され、すべての参加者からインフォームドコンセントが得られました。

糞便はプラスチック製のトイレ用帽子に収集され、4 °C で保存され、試験前に室温で 2 時間平衡状態になりました。尿を滅菌 500 mL ボトルに収集し、使用するまで 4 °C で保存しました。糞便の代用として、ASME 112.19.2 セラミック配管器具の試験基準に規定されているように、ラテックスケーシングに入ったものとケーシングをしていない状態の両方の大豆ペースト 64 のシリンダーを使用して実験が行われました。代理動物を用いた試験で使用される量は、100、150、200 g、または 50 g のサンプル 2 つです。実験で使用されるヒトの糞便の量は、特に指定がない限り、50 または 100 g です（高所得国の糞便の湿重量の中央値は 128 g です53）。正常な成人が毎回排尿する尿量は通常 250 ～ 400 mL の範囲で、中央値は 233 (1400/6) mL と報告されています53。

このシステムは、節水効果の高い水槽 (洗浄力 4.8 L) を備えた、後部出口トイレ (Saniflo 093) と下出口トイレ (Kohler Wellworth K-4198) の 2 つのタイプの市販の洗浄トイレでテストされました。便器内の水の量は、下出口便器の場合、1.85 ± 0.17 L と測定されました。ゴムシール付きの後部出口 P トラップコネクタ (署名ハードウェア) がトイレの 3 インチ出口に取り付けられ、3 インチ PVC パイプ、エルボ、およびコネクタを使用してカスタムデザイン部品に接続しました。便固定およびサンプリングパイプは SolidWorks を使用して描画され、PLLA および ABS 素材のいずれかで複数のバージョンで 3D プリントされました。穏やかな浸漬と、重力によって液体を収集するための底部にあるサンプリングポート開口部が含まれています。バルブ 1 は 3 インチのゲートバルブ、V2 は 2 インチのゲートバルブです。バルブ 3 は、デッドボリュームを最小限に抑えるために 3D プリント部品に含まれるコネクタに嵌合するボールバルブです。サンプル抽出用のバルブ 4 は、デッドレッグを確実にゼロにするサイズのゴム製ストッパーを備えた 3D プリントされたスイングタイプのクロージャーでした。

標準サンプリングで使用される便質量の測定には、潜血アッセイのサンプル収集キット (Pinnacle Biolabs) を使用しました。キットの溝付きスティック上の便の質量を化学天秤を使用して測定しました。天びんスケールは、収集キット内の緩衝液の量を測定するためにも使用されました (3 mL および 2.5 mL)。標準キットで調製した懸濁液の湿潤固形分を比率で計算しました。

スプレー浸食は、調整可能な電圧電源を使用してポンプ (12 V PowerFlo) を使用して実現されました。緩衝液は、1/4 インチのナイロンチューブおよびアダプターを介して精密ノズル (Lechlert 632.404) にポンプで送られました。流量は毎分 0.4 ～ 1.1 リットルの範囲で測定され、スプレー圧力はノズルメーカーのチャートから計算されました。それぞれ 35 g の糞便検体を使用しました。液化した検体を、15 mL の滅菌遠心分離管の底部サンプリングポートから重力によって収集しました。

噴霧侵食の結果を標準サンプリングと比較するために、侵食された懸濁液の湿潤固形分を測定しました。まず、乾燥固形分質量含有量を従来の全固形分法（105 °C のオーブンで少なくとも 4 時間）に従って測定しました。含水率の定義を考えると、MC (%) = (湿重量 - 乾燥重量)/湿重量; 湿った固体重量は、糞便の公称値 MC 75% を使用して計算されました。糞便の水分含量は 50 ～ 80% の範囲にあり、複数の研究の中央値は 75% です。この研究で報告されている固形分含有量の結果はすべて、湿った固形物の重量です。

細菌は、前述したように最確数 (MPN) 法を使用して数えられました 65。サンプルを滅菌遠心分離管に収集し、プレーティングするまで 4 °C で保管しました。各サンプルの段階希釈 (10-1 ～ 10-8) を、滅菌 48 ウェル細胞培養プレート内の溶原性ブロス中で 3 回作成しました。サンプルは分析前に 37 °C で 48 時間インキュベートされました。

ヒトヘモグロビン (Hb) を検出する 2 つのアッセイが使用されました: 1. Pinnacle Biolabs による第 2 世代 FIT、緩衝液中 50 ng/mL Hb (糞便 1g あたり 6 μg Hb に相当) が名目カットオフです。 2. Jant Pharmacal Corporation の Accutest® iFOBT、公称カットオフ値は緩衝液中 50 ng/mL Hb または糞便 1g あたり 50 μg Hb。

キットは製造元の指示に従って使用されました。溝付きスティックを便標本に 6 回刺し、次に溝付きスティックをバッファーチューブ (3 mL Pinnacle、2.5 mL Accutest) にねじ込み、手動で振盪しました。チューブの先端カバーを取り外して、カートリッジ上に懸濁液を分注した（ピナクルでは７５μＬとして測定３滴、またはアキュテストでは１００μＬとして４滴）。

ヒトヘモグロビン (H7379-1G、Sigma Aldrich) をスパイクに使用しました。フォームを維持しながら大便全体をスパイクするカスタム手順が開発されました。このプロセスは、補足ビデオS3に示すように、スパチュラを使用してスパイク溶液（固体100 gに対して溶液100〜500μL）と混合した便全体を50回手動で折りたたむことから構成されます。

このテストを再現可能にするために、一定量の便と尿をベンチ上の容器で混合し、スプレー浸食用のプロトタイプに手動で置きました。排尿量の上限は500mLとした。実際的な理由から、量は 5 分の 1 にスケールダウンされました。200 g/5 = 40 g の糞便、500 mL/5 = 100 mL の尿、および 1.85/5 = 0.4 L の水を組み合わせました (ボウルの体積を表す)。 1 分後、穴付きスプーンで糞便を収集し、プロトタイプに置き、10 psi で約 5 秒間スプレー侵食させました。

このテストを再現可能にするために、一定量の便とトイレットペーパーを容器に入れて、スプレー浸食用のプロトタイプに置きました。トイレットペーパーを加える前に、標準的な方法による潜血分析用に溝付き棒で検体を収集しました。便40gとトイレットペーパー6枚を使用し、400mLの水と混ぜてトイレットペーパーを完全に湿らせました。穴付きスプーンを使用して便とトイレットペーパーを集め、トイレットペーパーが便を覆うようにプロトタイプに置きました。 10 psi で約 5 秒間スプレー侵食を実行し、手順を変更せずに侵食された液体を収集しました。

糞便は、Duke Genomics and Computational Biology (GCB) Microbiome Shared Resource (MSR) からの指示に従ってサンプリングされました。金属製のスパチュラが便の中心に達し、約 250 mg のサンプルが抽出されました。このような採取は 6 回、便の別々の領域から行われ、それぞれが便の中心部に達しました。抽出したサンプルを 1.2 mL のクライオバイアルに入れました。

次に、同じ便を便器に入れて洗い流し、連続的に噴霧浸食された標本を 15 mL の滅菌遠心分離管に収集しました。収集した液体サンプルの一部を 1.2 mL クライオバイアルに移しました。標本 S1 については、6 回の複製を 5000 RPM で 10 分間遠心分離し、上清を廃棄して、分析用にさらに濃縮されたスラッジを提供しました。

-20℃で一晩保存した後、標本を氷上のGCBMSRに移し、標準プロトコルに従って処理するまで-80℃で保存しました。

全微生物 DNA は、Human Microbiome Roadmap Initiative によって標準化されたプロトコルを使用して抽出されました。 Qiagen PowerSoil ProDNA Isolation Kit を使用して DNA を単離しました。抽出された DNA 濃度は Nanodrop8000 分光計を使用して測定され、処理済みサンプルでは 64 ng/μL、従来のサンプルでは 269 ng/μL と豊富であることがわかりました。

単離された DNA サンプルの細菌群集組成は、アースマイクロバイオームプロジェクトのプロトコルに従って、フォワードプライマー 515 およびリバースプライマー 806 16S rRNA を使用したポリメラーゼ連鎖反応による 16S rRNA 遺伝子の V4 可変領域の増幅によって特徴付けられました。プライマー (515F および 806R) には独自のバーコードが含まれており、一度に数百のサンプルの多重化および同時配列決定が可能です。等モルの 16S rRNA PCR 産物を Promega GloMax を使用して定量し、配列決定のためにプールしました。配列決定は、Illumina MiSeq シーケンサーで 250 塩基対ペアエンド配列決定実行 (レーン配列決定実行あたり最大 384 サンプル) で実行されました。生のリードは、Qiime 2.0 を介してアンプリコン配列バリアント (ASV) カウントテーブルに処理されました。データの品質管理は、読み取りのノイズ除去と複製解除、および追加のフィルター処理によって行われました。分類法は、SILVA 132 データベースに対して q2-feature-classifier assign-sklearn naive Bayes 分類法を使用して ASV に割り当てられました。ネガティブ抽出コントロールは、R の Decontam パッケージを介した有病率と PCR 後の DNA 定量化閾値の両方を使用して、潜在的な汚染物質である ASV を除外するために使用されました。

静的濁度測定には、校正済み濁度計 Hach 2100Q (Hach、コロラド州、米国) を使用しました。 1 回のトイレ使用を、4.8 L の水槽フラッシュ容量中 130 g の便質量と 400 mL の尿という排泄物の生理学的値を使用してエミュレートしたところ、水中体積あたりの糞便量は 0.03 g/mL、尿量は 0.08 mL/mL となりました。 ASME 規格 112.19.2 で要求される 6 枚の単層シートの 4 つのボールの値に従って、トイレットペーパーの使用を表しました。

動的測定の場合、水で重量比 1:1 に希釈し、混合して 100 mL の試験測定を繰り返すための均一な懸濁液を得ることで、形成されたサンプルから溶解標本が得られました。

ケーブルとボードを備えたアナログ濁度プローブ (DF Robot 製 SEN0189) を Arduino Uno ボード (DFRduino UNO v3、DF Robot) に接続しました。 Arduino を使用してセンサーコードを開発し、記録を .CSV ファイルに変換する Teraterm ソフトウェアを使用して、0.25 秒の時間分解能で濁度センサーデータを記録しました。

マイクロバイオームデータを除くすべてのデータは Microsoft Excel 2016 でプロットされました。濁度データは GraphPad Prism 9.1.2 で分析されました。一対の濁度測定値間の差異の正規性は、Anderson-Darling 検定によってチェックされ、p 値 < 0.05 は統計的に有意であると見なされます。測定値の差が正規性検定に失敗したため (p = 0.0006)、ノンパラメトリック検定 (Wilcoxon 対応ペア符号付き順位検定) を使用して、ペアの測定値間の差が有意であるかどうかを判定しました (p < 0.05)。

この研究に関連するすべてのデータは、論文または補足資料に記載されています。すべての情報と資料は責任著者にリクエストできます。

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この研究の資金の一部は、Duke Bass Connection Program、Duke MEDx、および Duke Center for WaSH-AID への慈善寄付によって提供されました。資金提供者は、研究の設計、データの収集と分析、出版の決定、原稿の準備には何の役割もありませんでした。原稿とビデオを編集してくださった Mara Shurgot さんに感謝します。システムの操作ビデオの録画にご協力いただいた Ben Snyder 氏に感謝いたします。

電気およびコンピュータ工学、水、衛生、衛生および感染症センター (WaSH-AID)、デューク大学、ダーラム、ノースカロライナ州、米国

ソニア・グレゴ、クレア・M・ウェリング、グラハム・H・ミラー、ピーター・F・コーガン、ケイトリン・L・セルグレン、ブライアン・T・ホーキンス、ブライアン・R・ストーナー

デューク応用ゲノミクスおよび精密医療デュークセンター、デューク大学医学部、米国ノースカロライナ州ダーラム

ジェフリー・S・ギンズバーグ

米国ノースカロライナ州ダーラムのデューク大学医学部消化器科

ホセ・R・ルイス＆デボラ・A・フィッシャー

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SG、BTH、BRS がこの研究を考案し、計画しました。 CMWとKLSは便サンプルを調製して分析を実施し、GSGはマイクロバイオーム研究を指導した。 GHM と BRS は、エンジニアリングされたシステムを設計および組み立てし、運用データを収集しました。 PFC は濁度センサー実験用のコードを作成し、データ収集を実施しました。 SG、JRR、DAF がデータ解釈に関与しました。 SG、BTH、DAF、GSG が原稿を執筆しました。すべての著者はこの論文を読み、承認しました。

ソニア・グレゴへの通信。

SG、KLS、BTH、BRS は、排泄物サンプリングトイレに関する特許出願の発明者です (PCT/US 21/18765)。 SG、GSG、BRS は、排泄物サンプリングトイレ技術を開発する会社 Coprata Inc. の共同創設者です。 JRR は Coprata のコンサルタントです。 DAF は現在、Eli Lilly and Company に採用されています。 DAF は、結腸直腸がんスクリーニング検査を開発している Exact Sciences および Guardant Health のコンサルタントでもありました。他の著者には競合する利益はありません。

シュプリンガーネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

補足ビデオ S1。

補足ビデオ S2。

補足ビデオ S3。

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転載と許可

グレゴ・S.、ウェリング・CM、ミラー・GH 他腸の健康と病気を監視するためのハンズフリーの便サンプリングシステム。 Sci Rep 12、10859 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-14803-9

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受信日: 2022 年 3 月 6 日

受理日: 2022 年 6 月 13 日

公開日: 2022 年 6 月 27 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-14803-9

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