光のための光遺伝学的ツールキット

Volume sulle comunicazioni sulla natura

Nature Communications volume 14、記事番号: 1034 (2023) この記事を引用

4227 アクセス

19 オルトメトリック

メトリクスの詳細

抗生物質は、合成生物学および微生物学の重要な制御メカニズムです。耐性遺伝子は、目的の細胞を選択し、細菌集団を制御するために使用されますが、これまでのその使用はほとんど静的でした。抗生物質耐性の正確な時空間制御により、感受性と生存の動的な制御を必要とするさまざまな応用が可能になる可能性があります。ここでは、光誘導性 Cre リコンビナーゼを使用して、大腸菌の薬剤耐性遺伝子の発現を活性化します。私たちは、カルベニシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリンの 4 つの抗生物質に対する光活性化耐性を示します。青色光にさらされた細胞は致死濃度の抗生物質の存在下でも生存しますが、暗所に保管された細胞は生存しません。耐性誘導を最適化するために、染色体およびプラスミドベースの構築物を使用して、プロモーター、リボソーム結合部位、および酵素変異体の強度を変化させます。次に、誘導抵抗性を異種脂肪酸酵素の発現に結び付けて、オクタン酸の生産を増加させます。これらの光遺伝学的抵抗ツールは、細胞生存の時空間制御への道を開きます。

抗生物質耐性遺伝子は合成生物学で広く使用されています。それらはプラスミドの増殖を確実にするために遺伝子構築物に含まれています。耐性遺伝子もクローニング法において重要な役割を果たします。例としては、耐性遺伝子の発現が組み込みを成功させるための選択マーカーとして使用できる染色体挿入 1 や、薬剤耐性が代替配列と交換される前の中間選択機構として使用されるトランスポゾンライブラリーの作成などがあります 2,3。

抗生物質耐性遺伝子は合成生物学および微生物バイオテクノロジー研究の中心ですが、その発現を動的に制御する方法はほとんどありません。薬剤耐性を空間的および時間的に制御できるようになれば、合成生物学の研究に新たな道が開かれる可能性があります。同様に、Sheth et al.4 が合成生物学の構築物内のもう 1 つの普遍的な特徴である複製の誘導起点を開発したとき、生物学的データの保存 5 や全細胞リボスイッチ診断 6 などの新しい研究分野が生まれました。薬剤耐性の時空間制御により、生きた生体材料の空間パターン化 7、マイクロ流体システムからの単一細胞の選択 8,9、臨床抗生物質耐性における役割動態の理解の向上 10 が可能になる可能性があります。たとえば、耐性は水平遺伝子伝達イベントを通じて広がることがよくあります 11,12 が、単一細胞レベルで監視および制御するのは困難です。新しい制御システムは、耐性を獲得する細胞の異なる時空間配置がどのように集団レベルの増殖または崩壊につながるかを定量化する将来の研究の可能性を提供します。

光遺伝学的手法は、遺伝子発現を制御するための強力で広く使用されているツールです13。細胞への光の伝達は空間と時間で制御でき、計算ワークフローに直接組み込むことができます14、15。細菌の光遺伝学システムは、代謝フラックスの駆動 17、腸内微生物叢の制御 18、細胞形態の制御 19、共培養動態の制御 20 など、さまざまな用途で遺伝子発現を制御するために使用されています 13,16。光を使用して細胞の生存を制御することは、種を超えた微生物工学の焦点となっています。例えば、光遺伝学的制御は、Saccharomyces cerevisiae のヌルセオスリシン耐性 21 や Yarrowia liplytica のブレオマイシン耐性 22 を制御するために使用されています。大腸菌では、個別に設計された光ケージ化抗生物質 23 またはテトラサイクリンの自然な光感受性 24 を利用することにより、抗生物質耐性を制御するために光が使用されています。ただし、これらの方法は注意深いタンパク質工学を必要としたり、単一の薬剤に特有の特性を利用したりする必要があるため、さまざまな耐性メカニズムに簡単に一般化することはできません。別のアプローチでは、光誘導性プロモーターを使用して、クロラムフェニコール耐性を可逆的に制御しました20,25。このような方法は他の耐性遺伝子にも応用できる可能性があるが、実験はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ酵素の制御に限定されていた。光誘導性耐性の理想的なプラットフォームは、さまざまな抗生物質耐性遺伝子に対して一般化可能であり、合成生物学および微生物学の多様な研究を柔軟に可能にするために抗生物質の濃度全体にわたって調整可能です。

これらのニーズに対処するために、我々は青色光誘導性 Cre リコンビナーゼ OptoCreVvd2 を使用して抗生物質耐性遺伝子を活性化しました 26。このシステムを使用して、遺伝子とプロモーターの間のloxPに隣接する転写ターミネーターを切除し、465 nmの青色光への曝露後の遺伝子発現の増加を可能にします（図1a）。リコンビナーゼ技術は、遺伝子論理回路や細胞系統追跡など、遺伝子発現の堅牢で誘導性の制御を必要とするさまざまな用途に使用され、成功を収めています 27、28、29。我々は、比較的短い活性化時間、構築設計の柔軟性（loxP 部位の追加のみが必要）、および非誘導細胞での基礎発現が最小限であることから、このシステムを選択しました 26。さらに、Cre によって引き起こされる永続的なオフ-オンスイッチにより、光照射後の任意の時点で耐性のあるセルの選択が可能になり、光入力が除去された後のセルラーメモリーが可能になります。この不可逆性により複雑な時間的ダイナミクスは考慮されませんが、1 回の誘導により、培養物が光を透過できないほど高密度になる前に不可逆的な活性化を可能にしたり、光感受性株の曝露を最小限に抑えたりするなど、特定の用途では有利な利点が得られます。

a Split Cre リコンビナーゼフラグメントは、青色光誘導性 Vvd フォトダイマードメインに結合しています。青色光にさらされると、Cre が活性化して 2 つの loxP ドメイン間の転写ターミネーターを切除し、β-ラクタマーゼ (bla) の発現を増加させることができます。 OptoCre-bla の発現により、細胞は抗生物質カルベニシリンの存在下でも生存できるようになります。 b カルベニシリン中で 18 時間増殖させた、染色体に組み込まれた OptoCre-bla コンストラクトの最小発育阻止濃度 (MIC) 曲線。光誘発サンプルは、カルベニシリンに曝露する直前に青色光に 2 時間曝露されました。増殖はOD600で測定した(n = 3)。暗所と明所の両方の株には、耐性誘導構築物と OptoCreVvd2 が含まれています。対照（－）細胞は、耐性活性化構築物を含むが、Ｃｒｅリコンビナーゼを含まない。コントロール (+) 細胞には、構成的に発現された bla 遺伝子が含まれています。野生型 (WT) 細胞は、修飾やプラスミドを含まない MG1655 です。 c 異なる濃度のカルベニシリンにわたる OptoCre-bla 耐性活性化構築物の経時的成長。 d MIC データからの培養物のコロニー形成単位 (CFU) 数 (n = 6)。カルベニシリン中で 18 時間増殖させた後、サンプルを寒天プレート上にスポットし、翌日コロニーを数えました。 e OptoCre-bla の最適な活性化条件。耐性活性化構築物は、青色光に 2 時間曝露した後、300 µg/mL カルベニシリン中で増殖しますが、暗所に保管した場合は増殖しません。 18時間後の増殖をOD600によって定量化する。エラーバーは平均値付近の標準偏差を示します (n = 3 生物学的複製)。

ここでは、Cre を使用して 4 つの抗生物質耐性遺伝子の発現を誘導しました。これらの遺伝子は、合成生物学の応用における普遍性と作用機序の範囲を考慮して選択されました (表 1)。具体的には、臨床的に関連性があり、合成生物学で広く使用されているカルベニシリン/アンピシリン耐性遺伝子ベータ-ラクタマーゼ (bla) を選択しました。 β-ラクタム系抗生物質は細胞壁の生合成を阻害し、β-ラクタマーゼ酵素によって酵素的に分解されます12、30、31。また、30S リボソームサブユニットによる誤翻訳を引き起こす抗生物質であるカナマイシンに対する酵素耐性を提供するカナマイシンヌクレオチジルトランスフェラーゼ (knt) も含めました 32。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ (猫) は、クロラムフェニコールに対する酵素耐性をもたらし、50S リボソームサブユニットを妨害してタンパク質合成を停止させます 33。最後に、非酵素的排出ベースの抵抗機構としてテトラサイクリン排出ポンプ A (tetA) を組み込みました 34。テトラサイクリンは 30S リボソームサブユニットに結合してタンパク質合成を阻害します 35。これら 4 つの抗生物質には、殺菌剤 (カルベニシリン/アンピシリンおよびカナマイシン) と静菌剤 (クロラムフェニコールおよびテトラサイクリン) の両方が含まれます。この耐性メカニズムの選択は、このシステムを使用して制御できる幅広いメカニズムと、既存の細菌システムに組み込むことができる合成ツールの複数のオプションの両方を示しています。

抗生物質耐性遺伝子の発現を制御する場合、主要なパフォーマンス指標には、非誘導発現レベルと誘導発現レベルが含まれます。たとえば、β-ラクタマーゼのような強力な酵素を使用する場合、たとえ少量の基礎発現であっても、抗生物質の存在下で細菌が増殖する可能性があります。さらに、誘導状態での発現は、抗生物質の典型的な有効範囲に匹敵する薬物濃度で耐性を提供するのに十分である必要があり、ユースケースによってさらに異なる可能性があります。当社のプラットフォームでこれら 2 つの機能を最適化するために、遺伝子コピー数、プロモーター、リボソーム結合部位 (RBS)、およびコード配列を変更して、青色光への曝露後に細胞が生存する抗生物質の最小発育阻止濃度 (MIC) を調整しました。誤って生存を引き起こさないように十分に低い基礎発現レベルを維持します。さらに、単一細胞タイムラプス顕微鏡を使用して、耐性遺伝子の生きた活性化を実証し、細胞応答を特徴付けました。

最後に、我々は、耐性遺伝子を異種チオエステラーゼ CpFatB1 と共発現させて中鎖脂肪酸であるオクタン酸の生産を増加させることにより、バイオテクノロジー応用における光誘導耐性の有用性を実証しました。中鎖脂肪酸は、燃料、ポリマー製造、香料、香料に使用される高価値の生化学物質であり、代謝工学の重要なターゲットとなっています 36,37。ただし、CpFatB1 の誘導は代謝に負荷がかかり、生物生産用途における異種酵素の発現に共通する問題です。この課題により、研究者は、成長と生産の間のトレードオフのバランスをとるために経路の発現タイミングを正確に調整できるシステムの開発を促しました 38,39。たとえば、光誘導は、メバロン酸やイソブタノール 40 など、大腸菌における他の化学物質の生産を増加させるために使用されています。 OptoCreVvd2 を使用したシステムでは、CpFatB1 の光誘導と異種酵素の高発現のための抗生物質の選択を組み合わせると、CpFatB1 単独の光誘導よりも脂肪酸生成が大幅に増加しました。

この光誘導性耐性遺伝子のツールキットは、合成生物学における細胞制御機構として抗生物質の長期使用をサポートおよび拡張し、既存のシステムに空間的および時間的制御機構を追加し、光を抗生物質と組み合わせて使用する将来の応用の準備を整えます。細胞の挙動と生存を柔軟に制御します。

耐性遺伝子の光遺伝学的制御のために、青色光誘導性スプリット Cre リコンビナーゼ OptoCreVvd226 を使用しました。このシステムは、細胞が青色光に曝露されたときに、loxP 部位の間に配置された遺伝要素の切除を可能にします。切除は約 2 時間で完了でき、これは多くの既存の細菌光遺伝学システムと同等かそれよりも速いです 19,25,41,42。 OptoCreVvd2 を使用して、プロモーターと抗生物質耐性遺伝子の間の loxP サイト内に配置された転写ターミネーターを切除し、青色光への曝露後にのみ耐性遺伝子の発現を可能にしました。

我々は最初にこのシステムをβ-ラクタマーゼ（bla）耐性遺伝子（「OptoCre-bla」と呼ぶ、図1a）の転写を制御するために使用した。アンピシリンやカルベニシリンなどのベータラクタム系抗生物質は、細菌の細胞壁におけるペプチドグリカン層の生合成を阻害します。 β-ラクタマーゼ酵素は、抗生物質のβ-ラクタム環を加水分解することにより、β-ラクタム系抗生物質を不活化することができます43。これらの研究では、プラスミド選択用の抗生物質耐性カセットで一般的に使用される TEM-116 ベータ-ラクタマーゼを使用しました 44。我々は、この遺伝子構築物を大腸菌 MG1655 染色体の nupG の後に組み込みました。

光誘発性の抗生物質耐性を測定するために、OptoCre-bla の培養物を青色光に 2 時間曝露し、カルベニシリンの存在下で一晩増殖させ、暗所に保管した培養物と増殖を比較しました。細胞増殖における青色光依存性の違いを観察しました。増殖を防ぐために必要なMICは、暗所に保管された培養物では300μg/mL、青色光に曝露された培養物では1200μg/mLでした（図1b）。レポーターのみを含み、Creリコンビナーゼを含まないネガティブコントロール(-コントロール)細胞は、暗所で増殖させた完全構築物を含む細胞と同等の生存率を示し、非誘導状態ではblaの発現が低いことを示した。ネイティブプロモーターおよびRBSからのblaの構成的発現を有するポジティブコントロール（+コントロール）細胞は、ネイティブで耐性遺伝子を発現する完全耐性株で予想されるように、光誘導性株を超えるレベルを含む、テストしたすべての濃度のカルベニシリンで増殖しました。コンテクスト。さらに、ここで使用したカルベニシリンのどの濃度でも増殖しなかった大腸菌 MG1655 を野生型ネガティブコントロールとして含めました。

青色光で誘導された細胞が陽性対照株と同等の速度で増殖することを確認するために、青色光で増殖した細胞については広範囲のカルベニシリン濃度下で正常な増殖速度を示す時系列データを収集しましたが、光誘導を行わなかった細胞は増殖できませんでした。 (図1c)。抗生物質曝露後のコロニー形成単位（CFU）数を使用して、光学密度に基づくMICデータをさらに検証しました（図1d）。 MIC データは抗生物質の存在下での細胞増殖を正確に評価しますが、β-ラクタム系抗生物質は細胞フィラメント化も引き起こすため、細胞が分裂していないときでも光学密度 (OD) の測定値が増加する可能性があるため、Bla 耐性を CFU で確認することが特に重要になります。測定45。しかし、CFU カウントを使用した我々の結果は、光学密度測定も細胞生存率の明らかな差に反映されることを裏付けています 46。全体として、我々は、OptoCreVvd2を使用してベータラクタマーゼ耐性を誘導できることを発見し、bla耐性遺伝子構築物の暗闇と青色光で活性化される発現の間に強い差異があるカルベニシリンの濃度を特定しました（図1eおよび表2）。

次に、このシステムを他の抗生物質耐性遺伝子に一般化することを試みました。ターミネーターの切除は光と抗生物質耐性遺伝子の発現を容易に結びつけることができますが、これは光誘導性の生存と同じではありません。生存を制御するには、細胞が抗生物質に対して感受性を維持できるように、暗所では抗生物質耐性遺伝子の発現がまったくないか、または発現が低いことが必要です。この設計では、耐性遺伝子の誘導が耐性を付与するのに十分であることも必要とします。これら 2 つの特徴の閾値は、抗生物質の分解速度と輸出速度が異なる抗生物質耐性メカニズムの違いによって大幅に変化する可能性があります。したがって、私たちの研究室でのこれまでの研究では、OptoCreVvd2 が低い基礎発現と光による 10 倍の変化で蛍光タンパク質の発現を制御できることが示されています 26 が、単純に蛍光遺伝子を抗生物質耐性遺伝子に置き換えても、望ましい動作が得られない可能性があります。したがって、我々は、OptoCreVvd2 システムをさまざまな抗生物質耐性遺伝子 (bla、knt、cat、tetA) に適応させるための一般的なプロセスを定義し、カスタマイズされた範囲の抗生物質濃度で生存を示すことができました。

私たちのシステムを他の抗生物質に一般化するために、誘導コンストラクト内の bla をカナマイシンヌクレオチジルトランスフェラーゼ (knt) に交換して OptoCre-knt を作成することから始めました (図 2a)。抗生物質のカナマイシンは、細菌のリボソームの 30S サブユニットに結合することで誤翻訳を引き起こします。 knt 酵素は、カナマイシンへのヌクレオチドの転移を触媒し、抗生物質を不活化します 32。 OptoCre-knt の初期設計は光を使用した耐性活性化を示しましたが、この違いを確認するために必要なカナマイシン濃度は非常に高く、プラスミドに一般的に使用される 25 ～ 50 μg/mL と比較して 1000 μg/mL 以上でした (図 2b)。伝播24,44。抗生物質の一般的な使用濃度を一致させることは必須ではありませんが、これらの範囲に近い濃度を使用すると、生理的濃度でのコミュニティへの影響を研究できることや、全体的な抗生物質の必要性を制限できることなどの利点が得られます。

a カナマイシン耐性遺伝子 knt の発現レベルは、プロモーターと RBS の強度、および複製起点を変更することによって調整できます。プロモーターの強度は、P (中)、P* (中-低)、P** (低) の範囲です。 RBS の強さの範囲は R (強い) から R* (弱い) までです。 b プロモーター P、P*、または P** および RBS R または R* を備えた、染色体上の OptoCre-knt 活性化カセットの MIC 曲線 (n = 3)。 c p15A複製起点を持つプラスミド上のOptoCre-knt活性化カセットのMIC曲線（n = 3）。 d 300 μg/mL カナマイシンで染色体上の P* および R を使用した、最適な OptoCre-knt 活性化条件。 18時間後の増殖をOD600によって定量化する。エラーバーは平均値付近の標準偏差を示します (n = 3 生物学的複製)。

そこで、私たちは遺伝子を取り巻く遺伝子構造の最適化を通じて遺伝子発現を調整することに着手しました。基礎発現を低下させるために、knt 発現を駆動するプロモーターまたは RBS を弱めました。 OptoCre-kntのプロモーターとRBSを変更することで、耐性遺伝子の発現をシフトさせ、野生型MG1655のMICにはるかに近い抗生物質濃度で生存できるようにすることができました（図2b）。私たちは、さまざまなプロモーターと RBS の組み合わせをテストして、これらの変化がさまざまな抗生物質濃度で生存にどのような影響を与えるかを示しました。我々は、転写強度が中程度のPから中低のP*、低のP**までの範囲の、T7A1ウイルスプロモーターに基づいた様々な強度の構成プロモーターを使用しました。また、T7 ファージの遺伝子 10 の RBS 47 (R と表す) と、計算により弱くなるように設計した RBS 48 (R* と表す) も使用しました (図 2a)。 P を P* に変更すると、カナマイシンの暗状態での MIC が 200 μg/mL に減少しましたが、P** ではさらに 150 μg/mL に減少しました (図 2b)。予想通り、明状態の MIC も低下しましたが、依然として広範囲のカナマイシン濃度が維持され、生存が得られました。 P* の場合、カナマイシンレベルが 200 ～ 800 μg/mL の場合、光誘導生存率が得られましたが、P** の場合、その範囲は 150 ～ 500 μg/mL でした。 R * を P と組み合わせて使用すると、暗状態の MIC と光誘導生存に有効な濃度の両方が劇的に減少し、カナマイシンの濃度は 4 ～ 6 μg/mL の狭い範囲になりました。

これまでに使用されている染色体に組み込まれた構築物はバックグラウンド発現が低く、選択マーカーを必要としないという利点を持っていますが、プラスミドは光誘導性耐性システムに関して独自の利点を提供します。多くの耐性遺伝子はプラスミド上に自然に見出され、プラスミド起点により異なる株間でのシステムの便利な伝達が可能になります。さらに、細胞あたり約 10 コピーを持つ p15A 複製起点を含むプラスミド上の構築物の特徴を調べました (図 2c)49。染色体組み込みから p15A プラスミドに変更すると、OptoCre-knt を含む細胞が選択的に生存する抗生物質濃度の範囲が 5 倍以上増加しました。この増加にもかかわらず、プロモーターや RBS の強度を下げるなどの戦略が相殺効果をもたらす可能性があることがわかりました。また、p15AプラスミドベースのOptoCre-blaも特徴付けましたが、その基礎抵抗性は機能的であると考えるには高すぎました（補足図1a）。全体として、OptoCre-knt を使用したプラスミドベースのシステムでは、染色体挿入プロセスの必要性がなくなり、これらの構築物をさまざまな株や状況で使用することが容易になります。

これらの異なる設計によってもたらされる柔軟性により、複数の構造を開発することになりましたが、最適な構造はアプリケーション固有になる可能性があります。たとえば、ここで示されている低い濃度は野生型の MIC に近く、表現型に関連する抗生物質の濃度を使用して耐性獲得の特徴を調べる研究に最適です。対照的に、より高い濃度では、活性化された細胞のみが生き残るべき研究では、より厳密な細胞選択が可能になります。この最適化プロセスを通じて、元のコンストラクトと比較して、暗所と光に曝露した培養の間でカナマイシンの MIC 倍数の変化がより大きくなるコンストラクトを発見しました。特に、染色体上の OptoCre-knt 発現を駆動する P* と R は、最適化されたデザインの理想的な例です。 (図 2d および表 2)。

光誘導による生存には、細胞が抗生物質の影響を受けやすい厳密なオフ状態が必要です。私たちが実証したように、これは耐性遺伝子の基礎発現が低いことで達成できます。ただし、耐性酵素自体が弱ければ、誘導されない状態を最小限に抑えることもできます。したがって、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ (cat) 酵素を活性化する際、既知の変異を利用して酵素自体の強度を低下させました。クロラムフェニコールは、50S リボソームサブユニットに結合することでタンパク質合成を防ぎ、そこでペプチド結合の形成を阻害します。 cat 酵素は、アセチル CoA のアセチル基を抗生物質に結合させることで、クロラムフェニコールがリボソームに結合するのを防ぎます50。より弱い catT172A 変異体 51,52 を使用することで、細胞が生存する抗生物質の濃度を下げました (図 3a)。 OptoCre-cat デザインでは、プロモーター P と RBS R を使用し、cat と catT172A による光誘導生存率を比較しました。ここで、我々は、catと比較してcatT172Aによる暗オフ状態耐性の急激な減少を観察し、染色体に組み込まれた構築物上の野生型株の基礎耐性に比べて基礎耐性を低下させた(図3b)。また、p15Aプラスミド起点上のcatおよびcatT172AのMIC値の減少も観察しました（図3c）。この酵素変異体の最適化アプローチは、基礎遺伝子発現が最小限であっても高濃度の抗生物質に対して耐性を示す酵素を扱う場合、または基礎発現を制限することが難しいコピー数の高いプラスミドに対してこのシステムを使用する場合に特に役立ちます。。このアプローチは、耐性レベルを微調整できる別のポイントを作成し、p15Aプラスミド起点上のcatT172Aによって示される光誘発増殖の違いは、特に汎用性の高い最適化されたデザインです（図3dおよび表2）。

a クロラムフェニコール耐性遺伝子 cat によって与えられる耐性は、染色体またはプラスミド起源の catT172A 変異体を使用することによって下げることができます。 b 染色体上の天然酵素 cat または弱められた酵素 catT172A を含む OptoCre-cat 活性化カセットの MIC 曲線 (n = 3)。 c p15A起点を持つプラスミド上のcatおよびcatT172A活性化カセットのMIC曲線（n = 3）。 d 75 μg/mL クロラムフェニコールでプラスミド起点にプロモーター P および RBS R を備えた catT172A を使用した最適な活性化条件。 18時間後の増殖をOD600によって定量化する。エラーバーは平均値付近の標準偏差を示します (n = 3 生物学的複製)。

私たちは、露光特性を調整することで抵抗レベルを調整できるのではないかと考えました。これをテストするために、露光時間と強度を変更することで OptoCre-cat 設計をさらに特徴付けました (補足図 2)。私たちは、抵抗レベルが調整可能であり、光への曝露時間と青色光の強度の両方の組み合わせに依存することを発見しました。

私たちのデザインの多くに共通する問題は、基礎発現により、低いとはいえ野生型株で観察される耐性レベルを超える耐性レベルが生じることです。原則として、このリーク性は、自発的組換えイベント、ターミネーターの突然変異、またはターミネーターのリードスルーなど、いくつかの異なる問題の結果である可能性があります。 Cre を含まない (-) 対照株の loxP およびターミネーター領域を、0 μg/mL クロラムフェニコール条件と 75 μg/mL クロラムフェニコール条件の両方から配列決定しました。後者は、増殖を示した最高の抗生物質濃度条件を表します。両方の条件による配列決定の結果は、プラスミドの元の配列と一致し、漏洩発現が自然発生的組換えまたはターミネーター突然変異の結果ではないことを確認しました。これらの結果は、自発的組換えの証拠がなく、一貫して蛍光色素の基礎発現が低いことを示した、元の OptoCreVvd2 設計の特徴付けと一致しています 26。ターミネーターのリードスルーの可能性を軽減するために、我々は次に、元の設計の強力な BBa_B0015 ターミネーターを合成ターミネーター L3S2P21 に交換することで基礎発現を低下させようと試みました。これは、Chen et al.53 で特徴付けられた広範なセットで同定された最も強力なターミネーターでした。ただし、初期設計で使用したターミネータ (補足図 3) よりもさらに改善が見られなかったため、この方法をさらに追求することはありませんでした。最小限の基礎発現が重要なアプリケーションの場合、代替設計では、他のターミネーター 53、54 または異なる回路設計アプローチ 55、56、57 をテストできます。

光誘導は、tetA 排出ポンプなどの非酵素的抗生物質耐性メカニズムにも適用できます。抗生物質テトラサイクリンは 30S リボソームサブユニットに可逆的に結合し、タンパク質合成を阻害します。 tetA 流出ポンプは内膜に局在し、プロトンを取り込むことによってマグネシウム - テトラサイクリンキレート複合体を排出します 35。ネイティブの耐性レベルが高く、効力を低下させることを目的としたエンジニアリング努力を行った bla、knt、および cat とは明らかに対照的に、誘導性 tetA の初期設計は、プロモーター P およびプロモーターで発現させた場合、野生型 MG1655 を超える耐性を示さないことがわかりました。 p15A起点プラスミド上のRBS R（補足図1b）、以前にテストした構築物において最高レベルの耐性を生じた条件。これを補うために、強力なネイティブプロモーター Ptet とその対応する RBS Rtet を使用して、tetA 遺伝子 58 を完全に発現させて OptoCre-tetA を作成することを選択しました（図 4a）。このネイティブな構造を使用すると、OptoCre-tetA は染色体に組み込まれたときにある程度の活性化を示し (図 4b)、p15A プラスミド起点で強い活性化を示しました (図 4c)。注目すべきことに、野生型MG1655を上回る暗状態での基礎耐性が最小限であり、低テトラサイクリン濃度でOptoCre-tetAの活性化が可能でした。したがって、我々は、p15A プラスミドベースのバージョンがテトラサイクリン耐性の理想的な構築物であることを発見しました（図 4d および表 2）。

テトラサイクリン耐性遺伝子 tetA は、遺伝子の最大発現を可能にするために、ネイティブプロモーター Ptet およびネイティブ RBS Rtet を使用して発現されます。 b 染色体上の OptoCre-tetA の MIC 曲線、および c p15A プラスミド起点 (n = 3)。 d 4 μg/mL テトラサイクリンで p15A プラスミド起点を使用した、最適な OptoCre-tetA 活性化条件。 18時間後の増殖をOD600によって定量化する。エラーバーは平均値付近の標準偏差を示します (n = 3 生物学的複製)。

光遺伝学によって可能になる空間的および時間的精度により、これらの構築物を細菌の抗生物質耐性の単一細胞研究を含むさまざまな用途に使用することができます。耐性獲得が単細胞レベルでどのようにして細菌の生存につながるかは、遺伝子の水平伝播との関連で特に興味深い。既存の単一細胞水平遺伝子伝達研究は、これまでに遺伝子伝達速度を特徴づけ、クオラムセンシングとの重要な関連性を示してきました59,60。しかし、自然の遺伝子水平伝達の例はまれであり、特に抗生物質への曝露と比較して、空間的および時間的に制御することが困難です。以前の研究では、単一細胞における耐性の確率的獲得だけでは、表現型的に耐性のある細胞の増殖を引き起こすのに必ずしも十分ではないことも示されています61。水平的遺伝子伝達事象が集団内での耐性の拡大につながる時期を研究するには、抗生物質感受性を光遺伝学的に制御して単一細胞の耐性獲得をモデル化することが興味深いでしょう。これは、単一細胞における耐性獲得がいつ、どのように抗生物質回避につながるか、また特定の抗生物質の投与スケジュールと濃度が回避頻度にどのように影響するかを特徴付けるために使用できる可能性があります。

ここでは、アガロースパッド上の細胞に対して青色光を使用して細胞増殖を誘導することにより、このクラスの研究の最初のステップの概念実証を示します。タイムラプス顕微鏡を使用して、光活性化可能な抗生物質耐性を含む細胞を抗生物質を含むアガロースパッド上に配置し、暗所に保管した細胞の増殖を青色光に曝露した細胞の増殖と比較しました。これらの研究では、耐性遺伝子のサブセットに焦点を当て、それぞれ殺菌性抗生物質と静菌性抗生物質の例としてカナマイシンとクロラムフェニコールを選択しました。カナマイシンに対する染色体に組み込まれたOptoCre-knt耐性（図5aおよび補足ムービー1）、およびクロラムフェニコールに対するプラスミドベースのOptoCre-cat耐性（図5bおよび補足ムービー2）の耐性活性化を特徴付けました。われわれは、光誘導耐性を有する細胞は、構成的に耐性を示す陽性対照と比較して、増殖までに短い遅れを示すことを発見した。これは、転写ターミネーターを切除して耐性遺伝子の発現を可能にするのに必要な時間に相当すると考えられる。対照的に、細胞を暗所に保管すると増殖が阻害され、膜の完全性が失われる例が観察されました（補足ムービー1-2）。耐性誘発細胞の回復を定量化するために、映画の進行中に回復した最初のフレーム内の細胞の割合を計算しました（補足図4）。回復時間を細胞が最初に分裂する時点と定義し、光照射による OptoCre-knt の回復率は 70%、OptoCre-cat の回復率は 42% であることがわかりました (暗所の細胞では 13% と 4% でした)。ただし、特に暗闇の中で細胞が複数の分裂イベントを経験することはめったにありません（補足ムービー1-2）。これらのデータは明所と暗所の曝露の明らかな違いを示していますが、光曝露下での回復率が不完全なのは、抗生物質と光への同時曝露が原因である可能性があり、誘導される前に一部の細胞が生存不能になってしまう可能性があります。将来的には、マイクロ流体実験は、相対的な光誘導と抗生物質の添加タイミングの関数として回復率を評価するのに役立つ可能性があります。

a 400 μg/mL カナマイシンを含むアガロースパッド上でプロモーター P* および RBS R を使用した染色体 OptoCre-knt 耐性構築物の活性化、および b アガロースパッド上でプロモーター P および RBS R を含む catT172A を使用した p15A プラスミドベースの OptoCre-cat 耐性構築物の活性化60 μg/mL のクロラムフェニコールを含みます。顕微鏡画像は、暗闇または青色光での耐性活性化株の代表的なサンプルを示しています (スケールバー = 2 μm)。経時的な細胞数は各条件の複数のイメージング位置にわたって累積され、各プロットには OptoCre 耐性株と陰性および陽性対照が含まれます (n = 3 生物学的複製)。

細胞の部分集団の制御を必要とする将来の応用を見据えて、我々は、細胞の部分集団の抵抗を活性化するためにデジタルマイクロミラーデバイス（DMD）62も使用した。 DMD を使用すると、視野内の特定の領域のプログラムされた照明が可能になります。視野の半分を照射したところ、青色光で照射された領域の細胞が優先的に活性化されることがわかりました（補足図5）。明るい半分に比べてレベルは低いものの、視野の暗い半分の細胞のサブセットでいくらかの増殖が観察されました。 DMD 照明が開始されるまでこの活性化が見られないため、これは DMD からの光の拡散によるものである可能性があります。液体培養実験で使用した、より長く低強度の露光と比較して、DMD は強い光を長時間照射するように設計されています。これらの違いは、DMD アクティベーションプロトコルとセットアップが将来的にアクティベーションタイミングを改善するために最適化される可能性があることを示唆しています。

バイオテクノロジー応用におけるシステムの有用性を実証するために、我々は次に、cat または tetA とチオエステラーゼ CpFatB1 の共発現によるオクタン酸の収量の増加に焦点を当てました (図 6a-b)。 CpFatB1 は植物種 Cuphea palustris に由来し、大腸菌での発現用に最適化されています63。 CpFatB1の発現は細胞に負担をかけるため、その誘導発現と抗生物質耐性を直接結び付けると、両方の酵素を活発に産生する細胞の選択的な増殖が可能になり、それによって非発現細胞の増殖が防止されます（図6c）。我々は、p15A プラスミド骨格上の広い誘導範囲と最小の基礎抵抗性により、選択に catT172A 変異体を含む OptoCre-cat と OptoCre-tetA を使用しました。脂肪酸の生産には、オクタン酸の生産を促進することが以前に示されている高活性変異体 CpFatB1.2-M4-287 を使用しました63。耐性活性化構造を破壊することなくCpFatB1遺伝子の発現を最適化するために、本発明者らは、R'と呼ばれる強力なコンピューター設計されたRBSの発現下にCpFatB1遺伝子を耐性遺伝子のすぐ下流に配置した。抗生物質耐性のみを誘導するためのプロトコールと一致して、増殖期の初期に細胞を青色光に2時間曝露することによって誘導を実行しました。生物生産の観点から見ると、OptoCreVvd システムの利点はその不可逆性であり、これにより継続的な照明を必要とせずに CpFatB1 の永続的な活性化が可能になります。これにより、代謝工学の文脈において高密度細胞培養では光の透過が問題となる可能性がある、動的光誘導システムの問題が回避されます40,64。我々は、光誘導だけで、cat 系と tetA 系の両方でオクタン酸生成が大幅に増加することを発見しました。次に、抗生物質選択の導入により収量がさらに向上するかどうかを尋ねました。 OptoCre-cat では、150 μg/mL のクロラムフェニコールを添加すると生産が大幅に向上し、光誘導のみの条件よりも 29% 増加し、クロラムフェニコール濃度が高くても同様の性能が得られることがわかりました (図 6d)。単独または抗生物質を用いた光誘導も、同一の遺伝子構造および構成的Creリコンビナーゼ発現を有する構成的発現バージョンのCpFatB1と比較して収量の大幅な向上を示した（図6d）。 OptoCre-tetA では、1.5 μg/mL テトラサイクリンを添加すると、オクタン酸生成は光誘導単独より 150% 増加しました (図 6e)。テトラサイクリン濃度が高いほど収率はさらに向上し、6 μg/mL のテトラサイクリンを添加すると光のみの場合と比較して 300% の増加に達しました。これらの濃度は、それぞれの菌株の MIC 実験で見られる耐性レベルの上限にあります。これはおそらく、生物生産プロトコールで抗生物質が追加された時点での OD (OD600 ≈ 0.6) が高かったためと考えられます。 OptoCre-tetAによる誘導システムは、CpFatB1の構成的発現よりも生産を増加させませんでしたが、抗生物質の添加により、光のみよりも収率が大幅に向上しました（図6e）。重要なことに、cat および tetA コンストラクトの両方の構成的に発現されたバージョンは、光誘導バージョンと比較して不十分な増殖プロファイルを示しました (補足図 6)。構成構築物におけるこの増殖欠陥は、エスケープ変異体を引き起こし、生産株の安定性を低下させる可能性があるため、問題となる。したがって、オクタン酸生産と耐性選択を組み合わせると、連続生産に伴う負担のかかる成長欠陥を生じることなく、光誘導のみよりも高いオクタン酸収量が得られます。

a catT172A を使用した OptoCre-cat の活性化、または b OptoCre-tetA は、強力な RBS R' の下に薬剤耐性マーカーの下流に遺伝子を導入することによって CpFatB1 と結合します。 c 青色光は耐性遺伝子と CpFatB1 の発現を誘導しますが、コミュニティ内のすべての個体がその遺伝子を発現していることを保証するものではありません。非生産者は、CpFatB1 の負担により成長に有利です。クロラムフェニコールを添加すると、耐性遺伝子、ひいては CpFatB1 を産生しない個体の増殖が阻止されます。 d GC-MSによって測定されたOptoCre-catと組み合わせたオクタン酸生成。 e GC-MS によって測定された OptoCre-tetA と組み合わせたオクタン酸生成。有意性は両側ウェルチ t 検定を使用して決定されました: *P < 0.05; ns は重要ではありません。エラーバーは平均値付近の標準偏差を示します (n = 3 生物学的複製)。

OptoCre-cat と OptoCre-tetA コンストラクトを比較すると、OptoCre-cat は全体的により高い生産量を示しましたが、OptoCre-tetA は試験した範囲で抗生物質濃度が増加すると生産量がより大きく増加したことがわかりました。これは、耐性タイプの違い (酵素対流出) とそれらが個体群動態に及ぼす影響、または構築物の異なるプロモーター (P 対 Ptet) によるものである可能性があり、これらの構築物とその誘導をさらに最適化できる可能性があることを示唆しています。生産量を増やす。この研究は、代謝工学および生物生産用途において光を使用して抗生物質耐性を制御する可能性を示しています。

私たちは、4 つの抗生物質耐性遺伝子に対して光遺伝学的に制御されるシステムを開発し、最適化しました。我々は、青色光誘導性 Cre リコンビナーゼを使用して、bla、knt、cat、および tetA を活性化し、ある範囲の抗生物質濃度にわたって耐性を誘導することを示しました。これらの耐性遺伝子は複数のメカニズムにまたがり、合成生物学や微生物学の研究室で一般的に使用される抗生物質および耐性遺伝子を表します。誘導性耐性を設計する際の重要な側面は、非誘導状態および誘導状態での発現レベルであり、最適なレベルは耐性遺伝子の強度によって大幅に異なります。したがって、最適な基礎発現と耐性活性化の倍率変化を示す構築物を見つけるために、さまざまな強度のプロモーター、RBS、および酵素変異体をテストしました。 DNA レベルでコピー数を制御するために、nupG 領域と p15A 中コピープラスミド上の染色体に組み込まれた構築物も比較しました。これにより、実験設計の柔軟性が向上しました。プロモーター、RBS、酵素、およびコピー数レベルで耐性誘導コンストラクトを最適化することは、一般化可能なアプローチとして使用でき、発現を変更するための複数のオプションを提供して、実験上の制約を満たすコンストラクト設計の柔軟性を可能にすることがわかりました。たとえば、株設計の他の要素と適合するために天然プロモーター、特定のプラスミド起点、または特定の耐性タンパク質を必要とする研究は、このシステムがさまざまなユースケースまたは他の耐性遺伝子に適応しているため、対応できます。このシステムでは、上記の最適化アプローチを使用して、ここに示したものを超えて耐性遺伝子を拡張することもできます。発現を直接特徴付ける将来の実験も、設計をさらに最適化するための効果的な手段となる可能性があります。 qPCR やウェスタンブロットなどの技術を使用すると、転写および翻訳レベルの相対的な測定が可能になる可能性があります。あるいは、蛍光色素分子とのタンパク質融合により、融合が機能に影響を及ぼさないことがわかっている場合の測定が可能になる可能性があります。

ここでは、合成生物学と微生物学の両方の用途に広く適用できる 4 つの抗生物質耐性メカニズムを選択しました。これらの抗生物質と耐性遺伝子は、プラスミド選択マーカーとして、また合成生物学の制御システムでよく使用されます 24,44。応用例として、これらの構築物はマイクロ流体システムにおける単一細胞の選択に応用できる可能性があります。マイクロ流体デバイスから目的の単一細胞を選択することは困難であり、現在の方法では複雑な光トラップとバルブベースのマイクロ流体デバイスが必要です9。光誘導性抵抗性と DMD62 を組み合わせて光を正確に標的化することで、チップの変更や露光以外の追加のハードウェア要件を必要とせずに、デバイスの流出から目的の細胞株を抗生物質で選択することが可能になります。光を使用すると、計算ワークフローへの統合も可能になり、対象の表現型の自動スクリーニングと選択が容易になる可能性があります。永久スイッチは選択シグナルが失われないことを保証し、選択された細菌の子孫を活性化後の任意の時点で特性評価のために収集できるようにします。さらに、細胞ロジックにおけるリコンビナーゼの普及を考慮すると 28、このシステムは、細胞の生存を制御するロジック出力として、より大きなリコンビナーゼ回路とモジュール式に統合することができます。例えば、リコンビナーゼ制御の耐性遺伝子は、特定の環境条件（小分子、光、温度など）が満たされた場合にのみ細胞の生存を制御するために広く使用できる可能性があります28。このような場合、ワークフローを簡素化し、化学物質の誘導要件を最小限に抑えるために、ここで使用した IPTG 誘導バージョンではなく、OptoCreVvd2 の構成バージョンを使用する価値があるかもしれません。リコンビナーゼと選択された耐性遺伝子はどちらも合成生物学で一般的に使用されるため、光遺伝学的制御を既存の遺伝子システムに直接組み込むことができます。

さらに、これらの光誘導性抗生物質耐性遺伝子が、水平遺伝子伝達を研究するための合成系として有用であると我々は構想している。これらのシステムは、単一細胞耐性遺伝子の獲得イベントがどのように個体群の拡大または減少につながるかを調べるのに適しています。光を使用して耐性遺伝子の「獲得」を永続的に活性化できるため、まれで確率的な自然の水平遺伝子伝達イベントの観察に依存する必要がなくなります。特に、Bla は臨床現場で特に問題があり 31、腸がアンピシリンにさらされると広範囲に移行することが知られています 12。水平遺伝子伝達の単一細胞例を調べた最近の研究でも、クオラムセンシングとバイオフィルム構造が伝達事象の開始に重要である可能性があることが示されている 59,60 が、これまでの実験は頻度の低い水平伝達事象の研究に限定されている。重要なことに、すべての耐性獲得イベントが耐性集団の増殖につながるわけではないため、耐性獲得を総合的に制御することで、耐性を獲得した細胞がいつ、どのように増殖するかを明らかにできる可能性があります。将来的には、このシステムを変更して、抵抗をオフにしたり、可逆的に制御したりできるようにして、抵抗の獲得と損失の両方の研究が可能になる可能性もあります。光を誘導子として使用すると、化学誘導を使用して達成できるものを超えた、空間力学による研究も可能になります。ただし、複雑な 3D 空間ジオメトリでは、光の透過が問題になる場合があります。全体として、これらの光遺伝学的システムによってもたらされる空間的および時間的制御により、研究者は、どのような細胞配置と抗生物質治療スケジュールが、耐性細胞とその感受性の高い隣接細胞からなる微生物群集の拡大または崩壊につながるかを判断できる可能性があります61,65。

このシステムはまた、合成生物生産システムに新たな利点を提供し、オクタン酸の生産を増加させるために CpFatB1 を使用したパイロット研究で実証しました。 CpFatB1 の発現と酵素活性は効率的ではありますが、高レベルで負荷がかかるため、非生産者にとって成長上の利点がもたらされ、不正行為者を生み出す可能性があります 63,66。耐性遺伝子の発現と生物生産酵素を組み合わせることで、CpFatB1 を発現する細胞のみに増殖を制限することができ、光誘導のみを用いた同等のシステムよりも収量をさらに増加させることができます。この研究は、対象となる他の生物生産酵素に拡張したり、増殖経路で複数の酵素の発現を必要とする複数の遺伝子と同時発現させたりすることができます。

抗生物質耐性遺伝子は遍在する合成生物学の基本的なツールです。しかし、現在のところ、それらの発現を動的に調節できる方法はほとんどありません。光を使用して耐性を活性化する機能により、この中心となるツールが拡張され、時空間制御が改善され、細胞選択や抗生物質耐性獲得の研究における新たな応用が可能になります。

すべての抗生物質耐性アッセイでは大腸菌 MG1655 株が使用されます。我々は、Gibson アセンブリ法 67 を使用するか、構築物に長さ 100 塩基対未満のフラグメントが含まれる場合には Golden Gate アセンブリ 68 を使用してプラスミドを構築しました (補足表 1)。

染色体に組み込まれた構築物を、nupG の下流に Lambda Red リコンビナーゼシステム 1 を使用して挿入しました (順方向相同性部位: GGTTCTGGCCTTCGCGTTCATGGCGATGTTCAAATATAAACACGT、逆方向: GGCGTGAAACGGTTGTACGGTTATGTGTTGAAGTAAGAATAA)。 FRT 部位に隣接した抗生物質耐性カセットを使用して、成功した組み込みを選択しました (bla および cat 活性化コンストラクトには knt を、knt および tetA 活性化コンストラクトには cat を使用しました)。次に、これらのカセットは、Datsenko と Wanner1 のプロトコールに従って、温度感受性起点でプラスミドベースの FLP リコンビナーゼを使用して修復されました。最後に、次の実験の前に温度感受性プラスミドを修復しました。

OptoCreVvd2 発現に使用したプラスミドは Sheets et al.26 から得たものです。 bla 活性化研究のために、BglBrick プラスミド 44 の遺伝子と補足表 1 にリストされているプライマーを使用して、プラスミド選択カセットを bla から cat に変更しました。抗生物質耐性活性化プラスミドは、それぞれのプロモーター、RBS、およびレポーター遺伝子を変更することによって作成されました。 SheetsらのpBbAk-W4-loxTTlox-mRFP1。26。プラスミドの複製起点および bla、knt、および cat の配列は、BglBrick プラスミドシリーズから取得されました 44。 catT172A 変異は Ciechonska et al.51 から引用されました。 tetA の配列は、Hans-Martin Fischer69 によって寄託された AddGene プラスミド #74110 (pRGD-TcR) から得られました。 CpFatB1.2-M4-287 の配列は Hernandez Lozada らから入手しました。 Twist Bioscience63 を使用して合成されました。構成的 CpFatB1.2-M4-287 発現株は、光発現実験に使用したのと同じレポーターを、構成的に作用する pBbE5a-Cre と同時形質転換することによって作成されました。すべてのプラスミドベースの耐性構築物には p15A 起点が含まれています。 knt 活性化用のプラスミドベースのコンストラクトには選択マーカーとして cat が含まれ、bla、cat、および tetA 活性化用のコンストラクトにはプラスミド選択マーカーとして knt が含まれます。 bla および tetA のポジティブコントロールには、p15A 起点を持つプラスミド上にネイティブプロモーターおよび RBS を備えたそれぞれの遺伝子が含まれています。 knt および cat のポジティブコントロールには、プラスミドベースのレポーターを使用する研究の場合は p15A 起点を持つプラスミド上にネイティブプロモーターおよび RBS を持つそれぞれの遺伝子が含まれており、染色体に組み込まれたレポーターを使用する研究の場合は nupG 領域に組み込まれています。使用したプロモーターは、P (TTATCAAAAAGAGTA TTGCAT TAAAGTCTAACCTATAG GAATCT TACAGCCATCGAGAGGGACACGGCGAA)、P* (TTATCAAAAAGAGTA TTGTCT TAAAGTCTAACCTATAG GATTCT TACAGCCATCGAGAGGGACACGGCGAA)、および P** (TTATCAAAAAGAG) で示される、T7 A170 の中強度、中低強度、および低強度のバリアントでした。 TA TTGTAA TAAAAGTCTAACCTATAG GATTTT TACAGCCATCGAGAGGGACACGGCGAA)。下線は、元の T7 A1 プロモーターからの変異を示します。リボソーム結合部位 R は、T7 ファージの遺伝子 10 の RBS (TTTAAGAAGGAGATATACAT)47 です。 R* (ATCACTCTACGGCCAGCTGCAAAC) は、R (148 AU) と比較して 10 倍弱い翻訳強度 (14.8 AU) を持つように De Novo DNA バージョン 2.1 を使用してコンピューター設計され、R' (TTTGTTTAATTACTAAGCGGGAGGTTAT) は翻訳強度 (100,000 AU) を高めるように設計されました48。 ,71。 Sheets et al.26のオリジナルのpBbAk-W4-loxTTlox-mRFP1で使用されているrrnBターミネーターBBa_B0015は、特に断りのない限り、すべての構築物でloxPに隣接するターミネーターとして使用されました。強力な合成ターミネーター L3S2P2153 は IDT によって合成され、元の蛍光レポータープラスミドの mCherry バリアントにクローン化されました。これらの各要素を変更するために使用されるプライマーは、補足表 1 に含まれています。

この研究からのプラスミドと株、およびそれらの配列は、AddGene (https://www.addgene.org/Mary_Dunlop/) で入手できます。

プラスミドの維持に必要な100μg/mLのカルベニシリン、30μg/mLのカナマイシン、または25μg/mLのクロラムフェニコールを含む選択LB培地中で単一コロニーから菌株を一晩増殖させた。 OptoCreVvd2 スプリットリコンビナーゼ産生の誘導のために、培養物を 100 μM IPTG を含む選択 M9 最少培地 (2 mM MgSO4、0.1 mM CaCl2、および 0.1% グルコースを補充した M9 塩) 中で 1:100 で 2 時間リフレッシュしました。次いで、培養物を青色光に曝露するか、または暗所に２時間放置した。露光は、ウェルあたり 2 つの 465 nM 波長 LED (ThorLabs LED465E) を備えた 1 mL 培養物を使用する 24 ウェルライトプレート装置 (LPA)72 を使用して、ウェルあたり 120 μW/cm2 の合計出力で実行されました。光強度変化実験では、LPA を使用して、同じプロトコルに従って 5、60、または 120 μW/cm2 を 0.5、1、または 2 時間送達しました。

最小発育阻止濃度 (MIC) は、Wiegand et al.73 に概説されているプロトコールに基づいて測定されました。抗生物質ストックは、抗生物質を滅菌蒸留水 (カルベニシリン、カナマイシン、テトラサイクリン) または 99% エタノール (クロラムフェニコール) に溶解することによって作成され、濃度は CLSI 規格に基づいて効力について正規化されました 74。ＭＩＣを測定するためのアッセイプレートは、９６ウェルプレート中で１００μＬのＭ９最小培地中で抗生物質の段階希釈を行うことによって調製した。低グルコース培地は、栄養素を制限するのではなく炭素を制限する増殖条件を作り出すことで増殖のばらつきを減らすために使用されました45。抗生物質の濃度は、各実験の暗状態および明状態の培養の MIC レベルにわたる値を含むように選択されました。光曝露の直後に、培養物を各実験の最低の光学密度（OD）に希釈することによって標準化した。次に、正規化した培養物を 1/25 に希釈して 96 ウェルプレートに 3 つずつ入れ、37 °C で 18 時間一晩増殖させました。次に、BioTek Synergy H1 プレートリーダーを使用して、各ウェルの OD 吸光度の読み取り値を 600 nm (OD600) で測定しました。 OptoCre-cat レポーター株単独のサンプル後のシーケンスは、補足図に示すサンプルの 18 時間の増殖期間の終わりに、0 μg/mL および 75 μg/mL (MIC のすぐ下) 増殖条件から液体培養で行われました。 2. Phusion ポリメラーゼを使用して、ターミネーター領域を包含するフォワード (AAGCCATCCAGTTTTACTTTG) プライマーおよびリバース (CCAGCTGAACGGTCTGGTTATAGG) プライマーによってサンプルを増幅しました。

コロニー形成単位 (CFU) は、Sieuwerts et al.75 に概説されているマイクロスポッティングプロトコールに従って測定されました。 MIC プレートを一晩 18 時間増殖させた後、培養物を 96 ウェルプレート内の 1x M9 塩で 1:10 に連続希釈しました。 10-1から10-6までの希釈液を、各ウェルについてLB寒天プレート上に5μLずつ2つずつスポットプレーティングした(各条件についてn = 6)。プレートを 37 °C で一晩増殖させ、翌日コロニーを手動でカウントし、各サンプルのコロニーを数えられる最低希釈度を求めました。次いで、希釈レベルに、条件ごとに計数されたコロニーの平均数を乗算することによって、ｍＬ当たりのＣＦＵ数を計算し、プレートした５μＬの体積について正規化した。

単一コロニーから株を選択LB培地中で一晩増殖させた。 OptoCreVvd2の誘導のために、100μM IPTGを含む選択M9最少培地中で培養物を1:100で2時間リフレッシュした。次いでサンプルを、100μM IPTGおよび400μg/mLカナマイシン(knt活性化)または60μg/mLクロラムフェニコール(cat活性化)を含むM9最少培地で作製した1.5%低融点アガロースパッド上に置いた。パッドの乾燥を防ぐためにサンプルを 30 °C で増殖させ、18 時間にわたって 15 分 (knt 活性化) または 20 分 (catT172A 活性化) ごとに画像化しました。全フレーム照明実験では、Nikon Ti-E 顕微鏡を使用して細胞を 100 倍で画像化しました。青色光の露光は、顕微鏡ステージの上に固定された LED リング (Adafruit NeoPixel 1586) によって行われ、合計出力 330 μW/cm2 のカスタム Matlab スクリプトを備えた Arduino によって制御されました。画像は DeLTA 2.0 ソフトウェア 76 を使用してセグメント化され、分析されました。細胞分裂には手作業で注釈が付けられました。視野の半分を照明するデジタルマイクロミラーデバイス (DMD) 実験では、Nikon Ti-2 顕微鏡を使用して細胞を 100 倍で画像化しました。露光は、Nikon Ti-2 シャーシの照明光路に接続された DMD (Mightex Polygon 400) によって行われました。 DMD からの光は、各イメージングサイクルの 5 分間のうち 4 分間、合計 1.2% のパワー、つまり 160 mW/cm2 で 10% 減光フィルター (Chroma UVND 1.0) を通過しました。 Arduino Uno マイクロコントローラーを使用して、カメラ、照明源、および画像取得用の DMD を同期させました77。

単一コロニーから株を選択LB培地中で一晩増殖させた。 OptoCreVvd2を有する株については、2%グルコース78および100μM IPTGを含む選択M9最少培地で培養物を1:50でリフレッシュした。培養物をOD600 ≈ 0.2まで増殖させた。次に、OptoCreVvd2 を含む誘導培養物を青色光に 2 時間曝露しました。光曝露の直後に、150、300、または 600 μg/mL のクロラムフェニコール、または 1.5、3、または 6 μg/mL のテトラサイクリンを OptoCreVvd2 誘導細胞に添加しました。光誘導後 20 時間増殖させた後、400 μL の培養物を採取し、ガスクロマトグラフィー質量分析 (GC-MS) 定量用に準備しました。構成的に発現した CpFatB1 株を同一の条件で増殖させましたが、光も抗生物質も受けませんでした。脂肪酸の抽出と脂肪酸メチルエステルへの誘導体化は、Sarria et al.79 の記載に従って完了しました。ノナン酸 (C9) の内部標準を最終濃度 88.8 mg/L でサンプルに添加し、抽出前にボルテックスしました。サンプルは、DB-5MS カラムを使用する Agilent 6890 N/Agilent 5973 MS 検出器で分析されました。流量 4 mL/min で入口温度を 300 °C に設定しました。オーブン加熱プログラムは、最初に 70 °C で 1 分間に設定され、その後 30 °C/分で 290 °C まで上昇し、最終的に 290 °C で 1 分間保持されました。ノナン酸内部標準をオクタン酸力価の定量に使用しました。

MIC 曲線および棒グラフの OD600 値は、3 つのサンプルの平均値 ± 標準偏差として報告されます。 CFU 測定のコロニー数の値は、各 MIC データポイントの 2 つの希釈とプレーティングからなる 6 つのサンプルの平均として報告されます。 GC-MS を使用して測定された脂肪酸生成は、各条件の 3 回の生物学的反復の平均 ± 標準偏差として報告されます。脂肪酸生成の統計的有意性 (P 値) は、両側ウェルチ t 検定を使用して評価されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

結論を評価するために必要なデータは、原稿および/または補足資料に記載されています。ソースデータはこのペーパーに付属しています。

画像分析コードは、https://gitlab.com/dunloplab/delta で入手可能な DeLTA 2.0 アルゴリズムに基づいています。

Datsenko, KA & Wanner, BL PCR産物を使用した大腸菌K-12の染色体遺伝子のワンステップ不活化。手順国立アカデミー。科学。 USA 97、6640–6645 (2000)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nadler, DC、Morgan, SA、Flamholz, A.、Kortright, KE & Savage, DF ドメイン挿入プロファイリングを使用した代謝産物バイオセンサーの迅速な構築。ナット。共通。 7、1–11 (2016)。

記事 Google Scholar

ケイン、AK 他。トランスポゾン挿入配列決定における 10 年間の進歩。ナット。ジュネ牧師。 21、526–540 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sheth、RU、Yim、SS、Wu、FL、Wang、HH CRISPR 生物学的テープでの細胞イベントの長期にわたる多重記録。サイエンス 358、1457–1461 (2017)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

イム、SS et al. 生細胞内のデジタルから生物学的データへの堅牢な直接保存。ナット。化学。バイオル。 17、246–253 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dwidar, M. &yokobashi, Y. プラスミドのコピー数を制御することによるリボスイッチシグナル増幅。 ACSシンセ。バイオル。 8、245–250 (2019)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Sankaran, S. et al. 光で制御される生体生体材料を目指して。上級科学。 5、1800383 (2018)。

記事 Google Scholar

ラマンナ、J.ら。オミックス用の単一細胞のデジタルマイクロ流体分離。ナット。共通。 11、1–13 (2020)。

記事 Google Scholar

Luro, S.、Potvin-Trottier, L.、Okumus, B. & Paulsson, J. ハイスループット、長期タイムラプス顕微鏡後の生細胞の単離。ナット。方法 17、93 (2020)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

小金沢裕、梅谷正、佐藤正、若本裕、抗生物質曝露下での致死的遺伝子改変に対する歴史依存性の生理学的適応。 Elife 11、e74486 (2022)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sun, D.、Jeannot, K.、Xiao, Y. & Knapp, CW 論説: 水平遺伝子導入を介した細菌の抗生物質耐性。フロント。微生物。 1933 年 10 日 (2019 年)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

ラスキー、A.ら。マウスモデルにおける細菌の同時感染およびアンピシリン処理下でのβ-ラクタム耐性の移動度。フロント。微生物。 1591 年 11 月 (2020 年)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Lindner, F. & DIepold, A. 細菌における光遺伝学 – 応用と機会。 FEMS 微生物。改訂 46、1–17 (2022)。

記事 Google Scholar

Perkins, ML、Benzinger, D.、Arcak, M. & Khammash, M. 光遺伝学的にエミュレートされた細胞間シグナル伝達によるセルインザループパターンの形成。ナット。共通。 11、1–10 (2020)。

記事 Google Scholar

フォックス、ZR 他 MicroMator で反応性顕微鏡検査を可能にします。ナット。共通。 13、1–8 (2022)。

記事 Google Scholar

Liu、Z.ら。光による細菌のプログラミング - センサーと合成生物学への応用。フロント。微生物。 9, 2692 (2018)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Tandar, ST、Senoo, S.、Toya, Y. & 清水, H. 大腸菌の中心代謝フラックスを制御するための光遺伝学スイッチ。メタブ。工学 55、68–75 (2019)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ルイジアナ州ハートソーら。長寿を促進するための腸内細菌代謝の光遺伝学的制御。 Elife 9、1–16 (2020)。

記事 Google Scholar

ロマーノ、E.ら。 AraC を操作して、アラビノースの代わりに光に応答するようにします。ナット。化学。バイオル。 17、817–827 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Gutiérrez Mena, J.、Kumar, S. & Khammash, M. 光遺伝学的フィードバックによる細菌共培養組成の動的サイバー遺伝学的制御。ナット。共通。 13、1–16 (2022)。

記事 Google Scholar

Moreno Morales, N.、Patel, MT、Stewart, CJ、Sweeney, K. & McClean, MN 出芽酵母における公共財を制御するための光遺伝学ツール。 mSphere 6、e0058121 (2021)。

論文 PubMed Google Scholar

Wang、Z.ら。 Yarrowia liplytica の EL222 に基づく単一コンポーネントの青色光誘発システム。内部。Ｊ．Ｍｏｌ．科学。 23、6344 (2022)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Herzig, LM、Elamri, I.、Schwalbe, H. & Wachtveitl, J. 超高速タイムスケールでのクマリンケージ化合物からの光誘発抗生物質放出。物理学。化学。化学。物理学。 19、14835–14844 (2017)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Baumschlager, A.、Rullan, M. & Khammash, M. アンヒドロテトラサイクリンとテトラサイクリンの自然な化学光感受性を動的および設定値の化学光遺伝学的制御に利用します。ナット。共通。 11、1–10 (2020)。

記事 Google Scholar

Ohlendorf, R.、Vidavski, RR、Eldar, A.、Moffat, K. & Möglich, A. 夕暮れから夜明けまで: 光制御遺伝子発現のための 1 つのプラスミドシステム。Ｊ．Ｍｏｌ．バイオル。 416、534–542 (2012)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Sheets、MB、Wong、WW およびダンロップ、MJ 細菌光遺伝学用の光誘導性リコンビナーゼ。 ACSシンセ。バイオル。 9、227–235 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Siuti, P.、Yazbek, J. & Lu, TK 生細胞内にロジックとメモリを統合する合成回路。ナット。バイオテクノロジー。 31、448–452 (2013)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ワインバーグ、BH et al. 哺乳動物細胞およびマウスにおける高性能化学誘導性および光誘導性リコンビナーゼ。ナット。共通。 10、4845 (2019)。

論文 ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tian, X. & Zhou, B. 高効率と正確な時空間分解能による部位特異的組換えのための戦略。Ｊ．Ｂｉｏｌ．化学。 296、100509 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

澤、T.、小口、K. & 森山、K. 拡張スペクトル β-ラクタマーゼとカルバペネマーゼの分子多様性と抗菌剤耐性。 J. 集中治療 8、1–13 (2020)。

記事 Google Scholar

Mulvey 氏、MR および Simor 氏、AE 病院における抗菌薬耐性：どの程度懸念すべきでしょうか? CMAJ 180、408–415 (2009)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Pedersen, LC、Benning, MM & Holden, HM カナマイシンヌクレオチジルトランスフェラーゼ* の抗生物質および ATP 結合部位の構造研究。生化学 34、13305–13311 (1995)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ウェストバージニア州ショークロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ: 酵素学と分子生物学。 CRCクリティカル。Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｒｅｖ． 14、1–46 (1983)。

Stavropoulos、TA および Strathdee、CA 大腸菌における tetA(C) テトラサイクリン排出ポンプの発現により、浸透圧感受性が付与されます。 FEMS 微生物。レット。 190、147–150 (2000)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Chopra, I. & Roberts, M. テトラサイクリン系抗生物質: 作用機序、応用、分子生物学、および細菌耐性の疫学。微生物。モル。バイオル。改訂 65、232–260 (2001)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sarria, S.、Kruyer, NS & Peralta-Yahya, P. 再生可能エネルギーからの中鎖化学物質の微生物合成。ナット。バイオテクノロジー。 35、1158–1166 (2017)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Yan, Q. & Pfleger, BF 油脂化学物質の微生物合成のための代謝工学戦略の再検討。メタブ。工学 58、35–46 (2020)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Burg、JM et al. 大規模なバイオプロセスの競争力: 2 段階発酵における動的な代謝制御の可能性。カー。意見。化学。工学 14、121–136 (2016)。

記事 Google Scholar

Hartline, CJ、Schmitz, AC、Han, Y. & Zhang, F. 代謝工学における動的制御: 理論、ツール、およびアプリケーション。メタブ。工学 63、126–140 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

マサチューセッツ州ラルワニら。細菌の化学物質およびタンパク質生産のための lac オペロンの光遺伝学的制御。ナット。化学。バイオル。 17、71–79 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Schmidl、SR、Sheth、RU、Wu、A. & Tabor、JJ 光切り替え可能な大腸菌 2 成分システムのリファクタリングと最適化。 ACSシンセ。バイオル。 3、820–831 (2014)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ジャヤラマン、P. 他細菌における青色光媒介の転写活性化と遺伝子発現の抑制。核酸研究所 44、6994–7005 (2016)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Salverda, MLM、de Visser, JAGM & Barlow, M. TEM-1 β-ラクタマーゼの自然進化: 実験的再構築と臨床的関連性。 FEMS 微生物。改訂 34、1015–1036 (2010)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

アンダーソン、JC et al. BglBricks: 生物学的部品アセンブリのための柔軟な標準。Ｊ．Ｂｉｏｌ．工学 4、1 (2010)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Andreani, V.、You, L.、Glaser, P. & Batt, G. 抗生物質治療に対する酵素媒介反応を特徴付けるモデルベースのアプローチ: SIR 分類を超えて。 bioRxiv https://doi.org/10.1101/2021.07.16.452741 (2021)。

メレディス、HR 他生態学的耐性と回復力を適用して細菌の抗生物質反応を分析します。科学。上級 4、eaau1873 (2018)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Olins, PO、Devine, CS、Rangwala, SH & Kavka, KS T7 ファージ遺伝子 10 リーダー RNA、大腸菌における外来遺伝子の発現を劇的に増強するリボソーム結合部位。ジーン 73、227–235 (1988)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Cetnar, DP & Salis, HM 細菌オペロンの mRNA 安定性を制御する配列および構造決定基の体系的な定量化。 ACSシンセ。バイオル。 10、318–332 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Shao、B.ら。プラスミドのコピー数とプロモーター活性の単一細胞測定。ナット。共通。 12、1–9 (2021)。

記事 ADS Google Scholar

ショー、WV 他。 R プラスミドによって特定されるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼの一次構造。ネイチャー 282、870–872 (1979)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

Ciechonska、M. et al. 表現型選択による適応度を与える遺伝子の緊急発現。 PNAS Nexus 1、1 ～ 13 (2022)。

記事 Google Scholar

Lewendon, A. & Shaw, WV クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼによる遷移状態の安定化。スレオニン１７４に結合する水分子の役割。Ｊ．Ｂｉｏｌ．化学。 268、20997–21001 (1993)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

チェン、YJ 他 582 種類の天然および合成ターミネーターの特性評価とその設計制約の定量化。ナット。方法 10、659–664 (2013)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

AJ ハドソン & H.-J ヴィーデン多様な配列のターミネーターライブラリーの迅速な生成と定量的 Term-Seq を使用したそれらのパラメーター化。シンセ。バイオル。 4、ysz026 (2019)。

記事 CAS Google Scholar

Ho、JML、Miller、CA、Parks、SE、Mattia、JR、Bennett、MR サプレッサー tRNA 媒介フィードフォワードループは、細菌における漏洩遺伝子発現を排除します。核酸研究所 49、e25–e25 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Greco 、 FV 、 Pandi 、 A. 、 Erb 、 TJ 、 Grierson 、 CS & Gorochowski 、 TE セントラルドグマを活用して、遺伝子発現を複数レベルで厳密に制御します。ナット。共通。 12、1–11 (2021)。

記事 Google Scholar

Wang, T. & Simmel, FC 大腸菌における遺伝子制御のためのリボスイッチにヒントを得たトーホールドリボレギュレーター。核酸研究所 50、4784–4798 (2022)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Espah Borujeni, A.、Zhang, J.、Doosthosseini, H.、Nielsen, AAK & Voigt, CA RNA ポリメラーゼの動きとリボソームの使用を推測することによる遺伝回路の特徴付け。ナット。共通。 11、1–18 (2020)。

記事 Google Scholar

リー、B.ら。マイクロ流体工学を使用した、バイオフィルムにおける抗生物質耐性プラスミドの急速な拡散のリアルタイム研究。環境。科学。テクノロジー。 52、11132–11141 (2018)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

ファンゲステル、J. 他短距離クオラムセンシングは、細菌群集における遺伝子の水平移動をミクロンスケールで制御します。ナット。共通。 12、1–11 (2021)。

Google スカラー

Alexander, HK & MacLean, CR 確率論的な細菌集団動態は、単一細胞からの抗生物質耐性の確立を制限します。手順国立アカデミー。科学。 USA 117、19455–19464 (2020)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Allen, J. シグナリングの光遺伝学的制御のための DMD を使用したパターン化照明の応用。ナット。方法 14、1114–1114 (2017)。

記事 Google Scholar

ニュージャージー州ヘルナンデス・ロサダ他合成選択戦略によって単離された高活性 C 8 -アシル-ACP チオエステラーゼバリアント。 ACSシンセ。バイオル。 7、2205–2215 (2018)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

趙、EMら。微生物化学物質生産のための操作された細胞代謝の光遺伝学的制御。ネイチャー 555、683–687 (2018)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yurtsev、EA、Chao、HX、Datta、MS、Artemova、T. & Gore、J. 細菌の不正行為は、協力的な抗生物質耐性プラスミドの集団動態を推進します。モル。システム。バイオル。 9, 683 (2013)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sattayawat, P.、Sofian Yunus, I. & Jones, PR 有毒または液相に難溶性の化学物質を再生可能に生産するための概念としての生物誘導体化。手順国立アカデミー。科学。 USA 117、1404–1413 (2020)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ギブソン、DG 他最大数百キロベースの DNA 分子の酵素的集合。ナット。方法 6、343 ～ 345 (2009)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Engler, C.、Kandzia, R. & Marillonnet, S. 高スループット能力を備えたワンポット、ワンステップの高精度クローン作成方法。 PLoS ONE 3、e3647 (2008)。

論文 ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ledermann, R.、Strebel, S.、Kampik, C. & Fischer, HM Bradyrhizobium diazoefficiens およびその他のアルファプロテオバクテリアの効率的な突然変異誘発のための多用途ベクター。応用環境。微生物。 82、2791–2799 (2016)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Brunner, M. & Bujard, H. 大腸菌系におけるプロモーターの認識とプロモーターの強さ。 EMBO J. 6、3139–3144 (1987)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Salis, HM、Mirsky, EA & Voigt, CA タンパク質発現を制御するための合成リボソーム結合部位の自動設計。ナット。バイオテクノロジー。 27、946–950 (2009)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ゲルハルト、KP et al. 光遺伝学と光生物学のためのオープンハードウェアプラットフォーム。科学。議員番号 6、35363 (2016)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wiegand, I.、Hilpert, K. & Hancock、REW 寒天およびブロス希釈法による抗菌物質の最小発育阻止濃度 (MIC) の測定。ナット。プロトック。 3、163–175 (2008)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

CLSI。 M07. 好気的に増殖する細菌の抗菌薬感受性試験の希釈方法 (Clinical and Laboratory Standards Institute、2018)。

Sieuwerts, S.、De Bok、FAM、Mols, E.、De Vos、WM & Van Hylckama Vlieg、JET コロニー形成単位を決定するための簡単かつ迅速な方法。レット。応用微生物。 47、275–278 (2008)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

O'Connor, OM、Alnahhas, RN、Lugagne, JB & ダンロップ、MJ DeLTA 2.0: 単一セルの空間的および時間的ダイナミクスを定量化するための深層学習パイプライン。 PLoS コンピューティング。バイオル。 18、e1009797 (2022)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Lugagne, J.-B.、Blassick, CM およびダンロップ、MJ は、数千の単一細胞における遺伝子発現の予測制御をディープモデルで行っています。 bioRxiv https://doi.org/10.1101/2022.10.28.514305 (2022)。

Zhang、F.ら。転写制御因子 FadR の発現による脂肪酸生産の増強。メタブ。工学 14、653–660 (2012)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Sarria, S.、Bartholow, TG、Verga, A.、Burkart, MD & Peralta-Yahya, P. 中鎖脂肪酸生産を改善するためのタンパク質インターフェースのマッチング。 ACSシンセ。バイオル。 7、1179–1187 (2018)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

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この原稿に関して有益なコメントをくださった Heidi Klumpe に感謝します。 catT172A 変異体を作成してくれた Caroline Blassick と、この変異体を教えてくれた Mark Isalan に感謝します。この研究は、NIH 助成金 R01AI102922 および DOE 助成金 DE-SC0019387 によって支援されました。 MBS は、NIH トレーニング助成金 T32 EB006359 を通じて支援を受けました。

ボストン大学生物医工学部、ボストン、マサチューセッツ州、02215、米国

マイケル・B・シーツ、ネイサン・タグー、メアリー・J・ダンロップ

生物学的デザインセンター、ボストン大学、ボストン、マサチューセッツ州、02215、米国

マイケル・B・シーツ、ネイサン・タグー、メアリー・J・ダンロップ

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MBS と MJD が実験を考案し、設計しました。 MBS は抵抗誘導実験を実施し、データを分析しました。 MBSとNTは脂肪酸生成実験を実施し、データを分析した。 MBS と MJD は NT からの意見をもとに原稿を執筆しました

メアリー・J・ダンロップへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Sheets、MB、Tague、N. & ダンロップ、MJ 光誘導性抗生物質耐性のための光遺伝学的ツールキット。 Nat Commun 14、1034 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41467-023-36670-2

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受信日: 2022 年 6 月 10 日

受理日: 2023 年 2 月 13 日

公開日: 2023 年 2 月 23 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36670-2

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