エアプラグ付きマイクロ流体診断装置

Rapporti scientifici Volume 12,

Scientific Reports volume 12、記事番号: 12852 (2022) この記事を引用

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2 引用

3 オルトメトリック

メトリクスの詳細

加工食品中の偶発的なアレルゲン汚染の特定は、食品加工業界におけるリスク管理戦略において、食物アレルギーの事件を効果的に防止するために極めて重要です。ここでは、標的核酸検出用マイクロ流体デバイスをさらに改良するために、新設計の高耐圧性能を備えたパッシブストップバルブ「エアプラグインバルブ」を提案します。エアプラグインバルブを永久停止バルブとして実装することにより、10 個のマイクロチャンバーアレイへの液体の連続分注で最大許容流量 70 μL/min を達成できました。これは、以前のバルブで達成された流量の 14 倍です。片面ストップバルブを使用した配置。さらに、直径 20 mm の円内に 10 個のマイクロチャンバーをコンパクトに配置した診断装置を使用して、比色ループ媒介等温増幅アッセイに基づく複数の食物アレルゲン (小麦、そば、落花生) の同時検出を実証します。 60 °C で 60 分間アッセイを実行した後、それぞれ陽性対照サンプルと陰性対照サンプルとして使用した 3 種類の食物アレルゲンと茶植物の任意の組み合わせにより、マイクロチャンバー間の相互汚染がなく、正しい検査結果が得られました。。したがって、当社の診断装置は、食品の安全性とセキュリティを確保するための、迅速かつ簡単なサンプルから回答までのプラットフォームを提供します。

食物アレルギーは、特定の食品に含まれるタンパク質の吸入または摂取によって引き起こされる免疫介在性の有害反応です1、2、3。食物アレルギーの発生率と有病率はここ数十年で増加しており、世界的な健康問題を引き起こしています。アレルゲンは、皮膚（蕁麻疹）、気道（喘鳴、咳）、消化管（吐き気、嘔吐、下痢）などの急性アレルギー反応を引き起こすだけでなく、アナフィラキシーなどの重篤な状態を引き起こす可能性があります4,5。現在、多くの国で食物アレルゲンの表示が義務付けられ、法化されています。日本では、小麦、そば、落花生、卵、乳、えび、かにの特定原材料7品目を含む加工食品に対して食物アレルギー表示規制が設けられています。ガイドラインでは、アレルゲン性タンパク質を含む食品は、その濃度が 10 mg/kg (ppm) を超える場合には表示する必要があると規定されています6。食物アレルギーのある消費者にとって、たとえ微量のアレルゲンでもアレルギー反応を引き起こす可能性があります7。したがって、食品加工業界におけるリスク管理戦略において、食物アレルギーの事件を効果的に防止するには、誤ってアレルギー誘発物質に汚染された加工食品を迅速かつ簡単に特定することが極めて重要です。

さまざまな食物アレルゲンを検出するための多くの方法が評価されています8。酵素結合免疫吸着検定法 (ELISA) は、高感度、高特異性、使いやすさ、および高いサンプルスループットという利点により、標的タンパク質の定量分析に広く使用されています。したがって、食品業界や公的食品管理機関で食物アレルゲンを検出および定量するために最も一般的に使用されるアッセイの 1 つです9,10。食物アレルゲンの検出用に、いくつかの ELISA ベースの免疫診断検査キットが市販されています 11、12、13。しかし、タンパク質は、タンパク質ベースの検出法で使用される抽出プロセス中に意図しないタンパク質分解の影響を受けやすく、偽陰性の結果を引き起こす可能性があり、複雑な食品マトリックスには干渉する有機成分が含まれる可能性があり、それが偽陽性を引き起こす可能性があります 14,15。 DNA 分子はタンパク質よりも安定しているため、核酸ベースの検出方法がますます使用されており、その中でもリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応 (qPCR) は、特定の核酸 (DNA/RNA) ターゲットを増幅するために最も広く使用されている方法です。食物アレルゲンの検出における16、17、18、19。しかし、qPCR検査は高度な訓練を受けた人材と、増幅のための正確な温度設定値制御を備えた高価な機器（サーマルサイクラーなど）を必要とするため、費用対効果が高く使いやすい検出ツールではありません。

ループ媒介等温増幅 (LAMP) は、特殊な機器を必要とせずに現場で検出できる qPCR の代替手段として認識されています 20,21。 LAMP アッセイは、4 ～ 6 個の特別に設計された LAMP プライマーと高い鎖置換活性を持つ Bst DNA ポリメラーゼのセットを使用して特定の DNA 標的を増幅するもので、等温条件 (60 ～ 65 ℃) で 30 ～ 60 分で実行できます。 ℃)22,23。 LAMP増幅産物の検出には、従来の増幅後のゲル電気泳動による増幅産物の可視化、反応副産物として生成するピロリン酸マグネシウムによる濁度のリアルタイム測定、増幅産物のリアルタイム検出など、さまざまな方法が利用可能です。挿入蛍光色素 (SYBR Green I など) を使用した LAMP アンプリコン。さらに、指示薬色素を使用することで肉眼での比色検出も可能です。たとえば、フェノールレッドは、LAMP 反応に伴うアルカリ性から酸性への顕著な pH 変化を監視するために使用される pH 感受性指示薬色素であり、ヒドロキシナフトールブルー (HNB) は、遊離 Mg2+ 濃度の急速な減少を監視するために使用される金属指示薬色素です。 DNA 増幅中の不溶性ピロリン酸マグネシウムの形成によるイオン。しかし、従来のLAMP法には、複数の食物アレルゲンの現場での多重診断に応用するには解決すべき根本的な問題が残されています。つまり、対象となる食物アレルゲンごとに多くのサンプルと試薬の混合物を調製し、個別にテストする必要があります。この手順では、検査結果を得るために長くて面倒なサンプル前処理が必要なだけでなく、単一の食物アレルゲンを検査するのに比較的大量の LAMP 試薬 (一般に 10 ～ 25 µL) が必要です。これらの懸念に対処するために、Lab-on-a-chip 技術は、単一の操作で標的核酸を同時に検出するためのマイクロ流体デバイスにおける多重 LAMP アッセイを可能にする大きな可能性を秘めています 27,28,29,30,31,32,33,34 。

私たちの以前の研究 35、36、37 では、LAMP 法に基づいて標的核酸を多重検出するための多用途マイクロ流体デバイスを開発しました。マイクロ流体デバイスは、単一の操作でサンプル/試薬混合物を一連の反応マイクロチャンバーに順次分注できるため、迅速かつ簡単なサンプルツーアンサー診断のためのプラットフォームを提供できる可能性があります。作物の損失を最小限に抑え、農業における手頃な価格の食料の安定供給を確保することを目的として、トマトに感染する DNA 植物ウイルスだけでなく、60 日以内にウリ科に感染する 4 つの RNA 植物ウイルスも同時に検出できる、作製した診断装置の能力を実証しました。分35。さらに、我々は、救急医療における植物中毒の信頼できるスクリーニング方法を提供するために、有毒植物 Colchicum fallale を 60 分以内に検出できることを実証しました 36。さらに、当社のマイクロ流体デバイスを使用して比色逆転写 LAMP アッセイを 30 分間実行することにより、コロナウイルス感染症と、重症急性呼吸器症候群、季節性インフルエンザ A 型、2009 年パンデミックインフルエンザ A 型などによって引き起こされる感染症を同時に診断できます37。しかし、以前に提案された連続液体分注方法では、複数のマイクロチャンバーに分注するための最大許容流量は、流量だけでなく充填されたマイクロチャンバーの数にも比例して増加する流れ抵抗の増加によって制限されます。本研究では、マイクロ流体診断装置における連続液体分注性能の大幅な向上を目的として、マイクロ流体診断装置の永久ストップバルブ（以下、エアプラグインバルブ）として使用する新たなバルブ構造を設計しました。反応マイクロチャンバーの配列。今回提案するエアプラグインバルブの最大の特徴は、2個1組のパッシブバルブに到達した液体がエアプラグを介して互いに押し合うことで、印加圧力が相殺されるため高い耐圧性能が得られることです。円形に配置された 10 個のマイクロチャンバーを備えた最適に設計されたマイクロ流体デバイスを使用して、コムギ (Triticum aestivum)、ソバ (Fagopyrum esculentum)、ピーナッツ (Arachis Hypogaea) の特定の DNA ターゲットに基づいて 3 つの食物アレルゲンを同時に検出することを実証します。

我々は、ソフトリソグラフィープロセスとワックスリフロープロセスを組み合わせた、多重遺伝子検出に使用されるポリジメチルシロキサン（PDMS）ベースのマイクロ流体デバイスの製造プロセスを開発しました38。図 1a は、作製したマイクロ流体デバイス (サイズ 50 mm × 25 mm) の例を示しています。混合領域と分注領域の 2 つの主要部分で構成され、反応領域と検出領域としても機能します。アレイ内の 5 つのマイクロチャンバーは、それぞれマイクロチャンバーへの液体の導入とマイクロチャンバー内の空気の排出のための 2 つの独立した長方形のマイクロチャネル (幅 200 μm、高さ 50 μm) を介して相互接続されています。

多重遺伝的アレルゲン検出のための液体の連続分注を可能にし、ソフトリソグラフィプロセスとワックスリフロープロセスの組み合わせを使用して製造されたマイクロ流体診断デバイスの概略図。 (a) 5 つの反応マイクロチャンバー (それぞれ約 3 μL) のアレイで構成される作製された PDMS マイクロ流体デバイスは、緑色の水で満たされました。 (b) ワックス片を各 SU-8 チャンバー型パターンの上面に置きました。 (c) 135 °C で 3 分間加熱した後、均一な形状で形成された半楕円形のワックス型。 (d) PDMS マイクロチャンバーの走査型電子顕微鏡画像。 (e) PDMS マイクロチャンバーの 3D 画像と断面プロファイル。

使用した製造プロセスは次のように簡単に説明できます。まず、ネガ型の厚いフォトレジスト (SU-8 3050、MicroChem、米国マサチューセッツ州ニュートン) を 4 インチの単結晶シリコンウェーハ (e-Prize、横浜) 上にパターン化しました。日本）を単一ステップのフォトリソグラフィープロセスのモールドとして使用します。次に、深い局所的なマイクロチャンバー構造（深さ最大 1 mm）を作成するために、SU-8 型と 2.7 mg のワックス片（Ferris File-A-Wax、Freeman Manufacturing & Supply、米国オハイオ州エイボン）を同時に作製しました。プラズマアッシャー (JPA300; J-Science Lab、京都、日本) で 150 W の電力で 2 分間、低圧空気プラズマ表面処理を受けました。次に、ワックス片を各 SU-8 チャンバーパターンの上面の中央に配置しました (図 1b)。続いて、ワックス片を含むモールドをホットプレート上で 135 °C で 3 分間加熱することにより、リフロープロセスを実行しました (EC1200-N、アズワン、大阪、日本)。室温まで冷却した後、溶融ワックスの表面張力により、均一な形状の半楕円形のチャンバーモールドが得られました（図1c）。リフロープロセスの前にSU-8モールドとワックス片をプラズマ表面処理すると、おそらく表面汚染の除去により、それらの間の接着強度が著しく向上したことに留意すべきである。続いて、ホットプレート上で 80 °C で 40 分間硬化させた後、半楕円ワックス構造を備えた SU-8 マスターモールドを PDMS (Silpot 184、Dow Corning Toray、東京、日本) で複製しました。 SU-8 マスターモールドから PDMS を剥がした後、生検パンチ穿孔ツール (Kai Industries、岐阜、日本) を使用して、1 つの入口ポートと 2 つの出口ポート用の円形の穴 (直径 1.0 mm) を PDMS マイクロ流体デバイスに開けました。）。最後に、マイクロチャンバーとマイクロチャネルの両方を、シリコーンベースの粘着両面テープ (No. 5303 W; 日東電工、大阪、大阪) を使用して白色ポリ塩化ビニル (PVC) シート (EB-235; 大阪、光) で密閉しました。日本）。図 1d は、走査型電子顕微鏡 (S-3000 N、日立ハイテク、東京、日本) で取得した PMDS マイクロチャンバーの画像を示しています。極めて滑らかな曲面を有する三次元（3D）PDMSマイクロチャンバーが得られました。デジタル顕微鏡（VHX-7000、キーエンス、大阪、日本）で取得したPDMSマイクロチャンバーの3D画像と断面プロファイルから、半楕円形のPDMSマイクロチャンバーの最大深さは期待される設計値である約1 mmであることが明らかになりました（図1）。 1e)。

今回の研究では、10個のマイクロチャンバーを一列または円形に配置したマイクロ流体デバイスも同様のプロセスで作製した。さらに、PDMSデバイスとシリコーンベースの粘着性両面テープの界面での空気漏れの影響を調査するために、4インチの厚さのスピンコートされた薄いPDMS層に共有結合した修正PDMSデバイスを準備しました。空気プラズマ表面処理によるガラスウェーハ (AS-4; 東神理工、東京、日本)。実験では、流量センサー（Flow Unit、Fluigent SA）を備えたシリンジポンプ（YSP-201、YMC、京都、日本）または圧力駆動マイクロポンプ（Flow EZ 7000 mbar、Fluigent SA、ルクレムランビセートル、フランス）を使用しました。 ) を使用して液体をデバイスに導入しました。スマートフォンのカメラを使用して、複数のマイクロチャンバーへの液体分注プロセスのビデオ画像と複数のマイクロチャンバーの写真を撮影し、LAMP アッセイ後の色の変化を分析しました。

我々の以前の研究37では、各マイクロチャンバーに組み込まれた一対の受動的ストップバルブのバースト圧力を制御することにより、複数の反応マイクロチャンバーに液体を連続的に分注する方法を導入しました（図2）。簡単に言うと、分注手順は次のとおりです。まず、液体の流れは、一時的な停止バルブとして機能する受動的停止バルブ S1 (バースト圧力 P1 で設計) に到達した後に停止し、マイクロチャンバーに向けて方向転換されます。マイクロチャンバーが液体で満たされた後、液体の流れは永続的なストップバルブとして機能するパッシブストップバルブ S2 (バースト圧力 P2 で設計) で停止され、その後バルブを通過して 2 番目のマイクロチャンバーに向かって流れます。 P1 < P2 のため S1。バルブ S2 は、マイクロチャンバー内の空気の排出にも役立ちます。このプロセスを繰り返すことで、すべてのマイクロチャンバーを順番に液体で満たすことができます。分注プロセスでは、分注可能なマイクロチャンバーの数と最大許容流量は、当社が提案した連続液体分注理論によって理論的に設計でき、次の方程式で説明されます。

ここで、ΔP(L1)、ΔP(L2)、ΔP(L3) はそれぞれ特性長さ L1、L2、L3 のマイクロチャネル内に液体を流すのに必要な圧力差であり、m は完全に流されたマイクロチャンバーの数です。満たされました。 L1、L2、および L3 の定義は次のセクションで説明します。マイクロチャンバーの空間はマイクロチャネルよりもかなり大きいため、マイクロチャンバー内部の流れ抵抗は考慮されません。長方形のマイクロチャネル内の理論的な圧力降下 ΔP(L) は、次の方程式で与えられます 39:

ここで、W、H、L はそれぞれマイクロチャネルの幅、高さ、長さ、η は液体の動粘度 (水の場合、η = 1 mPa・s)、Q は体積流量です。

複数の反応マイクロチャンバーに液体を順次分注する方法の概略図。 (a) 異なる破裂圧力を持つ一対の片面ストップバルブを備えたマイクロチャンバーの詳細設計。 (b) 永久停止バルブ S2 の光学顕微鏡画像。 (c) 一時停止弁 S1 の光学顕微鏡画像。

分注理論 (式 1) によれば、同じ可能な数の分注マイクロチャンバーの流量を増やすには、マイクロチャンネルの長さ、特に L1 を短くし、一時停止バルブ S1 のバースト圧力 P1 を下げる必要があります。そして、永久停止弁Ｓ２の破裂圧力Ｐ２を増加させ、これにより、液体をマイクロチャンバー内に分注するのに必要な時間を短縮する。バルブ S1 の理論上の破裂圧力 P(g) (Pa) は次のように記述されます 37:

ここで、gはマイクロ流路の垂直側壁とその反対側の側壁に埋め込まれた凸状構造体（以下「片面ストップバルブ」という）との間の隙間、Hはマイクロ流路の高さ、θmは水接触角である。狭いギャップにおけるマイクロ流路の上面と側壁面の場合（PDMS の場合は θm = 108°）、マイクロ流路の底面の水接触角は θf です（シリコーン系接着剤両面テープの場合は θf = 102°） )、γ は液体の表面張力です (水の場合、γ = 0.073 N/m)。凸構造の後端のコーナー半径 r が無視できない場合、第 1 項の分母 g + r (1 ‒ cos β) は、角度 β のコーナー上の特定の位置と、ここで、βはマイクロチャネルの長手方向に垂直な方向と、凸状構造の角での固定に対応する液体空気メニスカスの位置との間の角度である。本研究では、永久停止弁 S2 の耐圧性能を向上させるための弁形状を新たに設計することを検討した。我々は、両面ストップバルブまたはエアプラグインバルブ（2つのバルブの設計については次のセクションで詳しく説明します）を実装することにより、マイクロチャンバーのアレイへの連続液体分注の理論的および実験的性能を分析し、それを次のセクションで比較しました。私たちの以前の研究で報告された片面ストップバルブのそれ。

この研究の目的は、加工食品に含まれる複数のアレルゲンを 1 回の操作で多重検出するための、迅速かつ簡単なサンプルから回答までのプラットフォームを導入することでした。私たちは、円形に配置された 10 個のマイクロチャンバーを備えた新しく設計されたマイクロ流体診断デバイスを使用して、小麦、そば、落花生からの 3 つの特定の DNA ターゲットを同時に検出できる可能性を検討しました。 3 つのアレルゲンを同時に遺伝子検出するためのマイクロ流体診断装置における多重比色 LAMP アッセイの操作手順は次のとおりです (補足図 S1): まず、標的の植物アレルゲン遺伝子を増幅するように設計された 3 つの特異的なプライマーセット 0.5 μL (小麦の場合は No. 2 と 7、ソバの場合は No. 3 と 8、ピーナッツの場合は No. 4 と 9)、およびポジティブコントロールとしてすべての植物種を識別するためのユニバーサルプライマーセット (No. 5 と 10) 0.5 μL を使用しました。各反応チャンバー（容量 ≈ 3 μL）内で事前にスポットし、ホットプレート上で 80 °C で 3 分間乾燥させます。続いて、マイクロチャンバーとPDMS表面のマイクロチャネルの両方を、シリコーンベースの粘着性両面テープを使用してPVCシートで密封した。シリンジポンプを用いて DNA サンプルと LAMP 試薬の混合物を流速 30 µL/min で複数の反応チャンバーに分注した後、入口ポートと出口ポートをポリエチレン接着剤とともにシリコーン系粘着性両面テープでシールしました。片面にテレフタレート剥離ライナー。ここで、剥離ライナーは、両面テープの粘着層を覆うように両面に積層される。マイクロ流体デバイスは、PVC シート、PDMS、およびポリエチレンテレフタレート剥離ライナーの間の界面での漏れを防ぐために、デバイスの両側に配置された 2 枚のガラスプレート (S9213; 松浪硝子、大阪、日本) の間にさらに機械的に挟まれました。機械的なクリッピングによるデバイスの変形を避けるために、PDMS デバイスを 2 枚の追加のガラス板の間に挟みました。最後に、デバイスを熱湯浴 (TB-2N; AS ONE、大阪、日本) に浸し、60 °C で 60 分間等温条件下で LAMP 反応を通じてターゲット DNA を増幅しました。

HNB (富士フイルム和光純薬、大阪、日本) を、LAMP 反応の可視比色検出およびエンドポイントの色定量化のための画像分析の指示薬として使用しました。私たちの以前の研究 37 では、CIE L*a*b* 色空間の表現に基づいて、LAMP アッセイ後の陽性反応 (スカイブルー) と陰性反応 (紫) の色の違いを定量的に評価する方法を開発しました。 CIELAB）。 CIELAB 色空間では、L* は明度を示し、a* と b* は色度座標を表します。簡単に説明すると、まず、スマートフォンのカメラで撮影した写真から、ImageJ (バージョン 1.52a、国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州、米国) を使用して各マイクロチャンバーの RGB 値を定量化し、その後 CIE XYZ カラーの XYZ 三刺激値に変換しました。空間。カラーパラメータ値 L*、a*、b* は XYZ 値を使用して計算されました。この計算方法については、以前に詳しく説明しました40。各反応チャンバー内の DNA サンプルと LAMP 試薬の混合物に、HNB を最終濃度 150 μM で添加しました。 2×反応混合物と熱安定性Bst DNAポリメラーゼを含むLoopamp DNA増幅キット（栄研化学、東京、日本）を使用して、LAMP反応を実行しました。 TaKaRa NucleoSpin Plant II キット (タカラバイオ、滋賀、日本) を使用して小麦、ソバ、落花生、茶の木 (Camellia sinensis; ネガティブコントロールとして使用) から DNA を抽出し、NanoDrop 1000 分光光度計 (Thermo Fisher Scientific) を使用して定量しました。、米国マサチューセッツ州ウォルサム）。 T. aestivum (引換券番号 JU2021TA10)、F. esculentum (引換券番号 JU2021FE11)、A. Hypogaea (引換券番号 JU2021AH12)、および C. sinensis (引換券番号 JU2021CS13) を含む 4 つの植物サンプルを植物園から入手しました。城西大学卒業。すべての標本は城西大学植物園に寄託されました。

私たちの以前の研究35、36、37では、ワックスリフロープロセスの代わりに、半球状ポリマービーズ（直径2 mm、SAYAKOBO、横浜、日本）を使用して、深く局所的なマイクロチャンバー構造を作成しました（補足図S2）。ポリマービーズを、エポキシ接着剤（Araldite、ハンツマンジャパン、神戸、日本）を使用して、室温で12時間、型として各SU-8チャンバーパターンに手動で接着しました。この製造プロセスにより、マイクロチャンバーの再現性が低くなりました。つまり、接着剤層の厚さの制御性が低く、接着界面で余分な接着剤が絞り出されるため、特にマイクロチャネルとマイクロチャンバーの入り口の交差点での複製精度が低下しました。このようなプロセスの失敗により、予期せぬ気泡がマイクロチャンバー内に閉じ込められることがありました (図 3a)。この好ましくない結果は、マイクロチャンバーの入口の段差または障害物の周囲での不均一な流れによって引き起こされた可能性が最も高くなります。 20 台のデバイスと合計 100 個のチャンバーを使用した実験で、気泡なしでサンプルが分注される確率は 87.0% でした。ワックスを使用した熱リフロープロセスを実装することにより、20 個のデバイスと合計 100 個のチャンバーを用いた実験で、気泡なしで塗布できる確率が最大 100% まで大幅に向上しました (図 3b)。

(a) 半球ポリマービーズと (b) ワックスリフロープロセスを使用して製造された PDMS マイクロチャンバー間の液体分配挙動の比較。前者はマイクロチャンバー内に予期せぬ気泡が捕捉されることがありましたが、後者はそうではありませんでした。

本研究では、バルブS2の幾何学的形状を変更することで耐圧性能を向上させました。図4aに示すように、バルブS2のギャップ距離は、マイクロチャネルの両側壁に埋め込まれた互いに向かい合う2つの凸状構造（キャピラリーストップバルブ41と呼ばれる）によって決定されます。当社装置では、S1 バルブが片面ストップバルブであるのに対し、S2 のバルブ構造を両面ストップバルブと呼びます。両面ストップバルブの理論破壊圧力は次のように導出されます。

両面ストップバルブを備えた 10 個のマイクロチャンバーのアレイにおける連続液体分注のパフォーマンスに対する流量の影響を示す実験結果。（ａ）一時停止弁Ｓ１としての片面停止弁と永久停止弁Ｓ２としての両面停止弁とを含む一対の受動停止弁を備えた反応マイクロチャンバーの詳細設計。マイクロチャンバーには、(b) 10、(c) 20、または (d) 50 μL/分の流量で青色の水が順番に満たされました。

両面ストップバルブ S2 のギャップ距離は実験的に測定され、g2 = 21.4 μm (図 4) となり、マイクロチャネル (W = 202.1 μm、 H = 59.0 μm)。同じギャップ距離（g2 = 21.4 μm）の片面ストップバルブの理論上の破壊圧力は、P2 = 4.47 kPa と計算されました。このように、S2を両面ストップ弁とすることで、片面ストップ弁に比べて破壊圧力を1.3倍に高めることができます。 5対のS2が直列に配置されていることに注意してください（図4a）。これは、1つまたは複数のバルブのギャップ距離（g2）および/またはコーナー半径（r2）が予期せぬ理由により設計値とならないと想定したためです。ソフトリソグラフィーにおけるプロセスの失敗。したがって、5 つのバルブのうち最も高い破裂圧力 (P2) を持つバルブが、マイクロ流体デバイスの実際のバルブ性能限界を決定します。比較のために、片面ストップバルブＳ１のギャップ距離ｇ１が４０．５μｍの場合、理論破裂圧力Ｐ１は２．７９ｋＰａとなった。図4aに示すように、マイクロチャネルの長さL1、L2、およびL3は、5.0 mm、1.0 mm、0.2 mmに設定されました。

図 4b は、流速 10 µL/min で圧力駆動マイクロポンプを使用した場合、10 個のマイクロチャンバーのアレイが青色の食用色素 (0.1% w/v) で着色された水で完全に満たされたことを示しています。予想通り、両面ストップバルブ S2 を使用した場合に分注可能なマイクロチャンバーの数は、以前に使用した片面ストップバルブ S2 で同じ流量で達成できた 6 つのマイクロチャンバーと比較して 1.7 倍増加しました 37。ただし、理論的な分注モデルで予測されたように、流量が 20 μL/分 (図 4c およびビデオ S1) または 50 μL/分 (図 4d) に増加すると、分注できるマイクロチャンバーの数は 5 つと 2 つに減少しました。、それぞれ。

方程式で説明されている調剤理論によると、 (1–4) に示すように、最大許容流量は流れ抵抗 ΔP(L1) の増加によって制限されます。これは、流量だけでなく、満たされたマイクロチャンバーの数にも比例して増加します。この研究で設計されたマイクロチャネルと一対の受動停止バルブの幾何学的寸法を使用する場合、10 個のマイクロチャンバーを分注するための最大許容流量は約 10 μL/分に制限されました。なお、永久ストップバルブS2のギャップ距離（設計値としてg2=20μm）をさらに小さくすると、耐圧性（P2）は向上しますが、SU-8モールドのパターニング精度に悪影響を及ぼす可能性があります。フォトリソグラフィーによる。

そこで、我々は永久ストップバルブの新設計バルブ構造を提案し、これを「エアプラグインバルブ」と名付けました。図５ａに示すように、マイクロチャンバー内の空気を排気するために、上部マイクロチャネル（以下、空気排出マイクロチャネルと呼ぶ）の下流および上流に２つの両面ストップバルブＳ２を配置した。前のセクションで述べたように、製造プロセスでの予期せぬ故障のリスクを回避するために、5 対の S2 が直列に配置されました。今回提案する空気プラグインバルブの最大の特徴は、隣り合うマイクロチャンバーが液体で完全に満たされると、隣り合うマイクロチャンバーの2つのS2バルブを繋ぐ排気マイクロ流路の部分に空気が閉じ込められることである（図5a）。例えば、第 1 のマイクロチャンバーの両方の S2 バルブは、式 (1) の右側で与えられる全圧力にさらされます。（５ａ）第２のマイクロチャンバーが液体で満たされている間。この条件は、式 (1) の m = 1 の場合に対応します。 (1) 液体が第 2 マイクロチャンバーの S2 バルブに到達する直前に、S2 バルブにかかる圧力が最大になります。しかし、第１マイクロチャンバーと第２マイクロチャンバーのＳ２バルブ間のエアトラップが完了すると、第１マイクロチャンバーのＳ２バルブにかかる圧力は式（１）の右辺の圧力まで低下する。 (5b) 2 つのバルブに到達した液体がエアプラグを通じて互いに押し合い、その結果、加えられた圧力が相殺されるためです。

空気プラグインバルブを備えた 10 個のマイクロチャンバーアレイにおける連続液体分注のパフォーマンスに対する流量の影響を示す実験結果。 (a) 空気プラグインバルブを永久停止バルブ S2 として備えた反応マイクロチャンバーの詳細設計。空気排出マイクロチャネル内で互いに対向する 2 つの両面ストップバルブのセットで構成されます。マイクロチャンバーには、(b) 10、(c) 30、または (d) 70 μL/分の流量で緑色の水が順次充填されました。写真中のLLは漏れ長さを表します。

永久停止弁 S2 の破裂圧力 P2 は、式 (1) で与えられる制約を満たすようにのみ設計されるべきであると結論付けることができます。 (5a)、すなわち、液体が次のマイクロチャンバーに完全に分注されるまでの間のみ、流動抵抗を有することが要求される。これは、S2 に空気プラグインバルブを実装することにより、分注可能なマイクロチャンバーの数に対する制限が取り除かれたことも意味します。

図5b〜dは、10個のマイクロチャンバーすべてが、緑色の食用色素（0.1％w/v）を含む水で10、30、および70μL/分の流量で順番に満たされたことを示しています（ビデオS2）。したがって、空気プラグインバルブにより、70 μL/分未満の流量で 10 個すべてのマイクロチャンバーへの分注が成功しました。式で与えられる制約によると、 (5a) に示すように、この研究で使用した設計のマイクロチャネルと一対の受動停止バルブの幾何学的寸法を考慮すると、理論上の最大許容流量は、10 個のマイクロチャンバーを分注する場合に約 70 μL/分に制限されます。したがって、実験結果は理論的に予測された最大許容流量と十分に一致しました。エアプラグインバルブの導入により、従来の両面ストップ弁の7倍、片面ストップ弁の14倍の許容流量を達成しました。以前の研究 (最大許容流量は 10 個のマイクロチャンバーで 5 μL/分でした)37。特に、永久停止バルブの耐圧性が劇的に向上したことにより、マイクロ流体デバイスに液体を手動で導入できるようになりました (ビデオ S3、推定平均流量: ~ 40 μL/分)。

予期せぬことに、分注が進むにつれて、空気プラグインバルブによって以前に固定されていた液体空気メニスカスが徐々に下流に漏れ、最初のマイクロチャンバーでは上流と下流の両方に漏れることが観察されました（図5bの黄色の矢印） –d)。この予期しないバルブの漏れ挙動は、PDMS42 のガス透過性によるものである可能性が最も高くなります。漏れ長さ (LL) は、装置内のバルブの上流位置が大きくなるにつれて増加するだけでなく、流量が増加するにつれて増加するように見えました。図 6a は、流量 10 ～ 70 µL/min における各マイクロチャンバーの下流の空気プラグインバルブでの LL を示しています。 LL の値は、10 番目のマイクロチャンバーが完全に満たされた直後に推定されました。 LL は、バルブが下流に位置するにつれて徐々に減少し、0.8 mm に達すると、その後はより大きな負の傾きで減少します。 5 対の S2 を排気マイクロチャネル内に直列に配置し、最初のバルブ凸状構造の後端 (LL のゼロ位置に設定) と 5 番目のバルブの後端の間の全長は 0.8 mm になりました (図5a)。 LL = 0.8 mm 付近の遷移領域は、マイクロチャネルの幾何学的差異、つまり、マイクロチャネルの両側壁に埋め込まれた対向する凸状構造によるマイクロチャネル幅の周期的変動による可能性が最も高くなります。

漏れ長さ (LL) の実験的解析。 (a) 流量 10 ～ 70 µL/min における各マイクロチャンバーの下流の空気プラグインバルブでの LL 値。グラフ中の白抜きおよび黒塗りの記号は、それぞれシリコーンベースの粘着性両面テープで封止され、薄い PDMS 層に共有結合された PDMS マイクロ流体デバイスのデータを表します。 (b) 4 インチのガラスウェーハ上にコーティングされた薄い PDMS 層に共有結合した PDMS デバイスのデータは、各エアプラグに加えられる内圧 (P) と自然対数の積の関数として再プロットされました。時間 (ln(t))。

PDMS デバイスとシリコーン系接着両面テープの界面での空気漏れの影響を調査するために、4 インチのガラスウェーハ上にコーティングされた薄い PDMS 層に空気によって共有結合する修正 PDMS デバイスを準備しました。プラズマ表面処理。修正されたPDMSデバイスについて測定されたLL値も図6aにプロットされています。 2 種類のデバイス間に大きな違いがないことがわかります。したがって、PDMS デバイスと粘着テープの間の界面で発生した空気漏れは無視できます。さらに、すべての空気プラグインバルブ S2 は式 (1) で説明される印加圧力を受けましたが、 (5b) 隣接するバルブ間のエアトラップが完了した直後、第 1 マイクロチャンバーと第 2 マイクロチャンバーの間にトラップされたエアプラグは、下流にある他のエアプラグよりも大きな内圧を示しました (図 S3)。式1によると、分注されたマイクロチャンバーの数は増加します。 (1)。したがって、LL は、上流に位置するバルブのエアプラグで増加するだけでなく、式 (3) で推定できる流動抵抗の増加により、より高い流量でも増加すると考えられます。 (2)。

図6bでは、4インチのガラスウェーハ上にコーティングされた薄いPDMS層に共有結合したPDMSデバイスのデータが、各エアプラグにかかる内圧（P）と自然対数の積の関数として再プロットされています。時間 (ln(t))。 P は理論的には式に従って計算されました。 (1)、t は、特定のエアプラグが完成してから 10 個すべてのマイクロチャンバーが完全に水で満たされるまでに経過した合計時間として実験的に決定されました。データは補足情報の表 S1 にリストされています。グラフに示すように、LL≧0.8mmの条件では、流量、バルブ位置に関わらずLLは以下のように表されます。

ここで、決定係数 (R2) は 0.823 と推定され、式 (1) に示されている仮定が当てはまっていることがわかります。 (6)は有効です。したがって、マイクロ流体デバイスの設計プロセス中であっても理論的に LL を予測できます。ポンピングによってマイクロ流体デバイスへの液体の流れが停止すると、入口チューブが取り外され、マイクロチャネルとマイクロチャンバーの両方の内圧が即座に低下したため、空気プラグインバルブでの液体の漏れが大幅に減少したことに注意してください。大気圧まで下がります。漏れの問題を克服する基本的な方法は、PDMS をポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマーなどのガス透過性の低いエンジニアリングプラスチックに置き換えることです。

我々は、小麦（T. aestivum）、ソバ（F. esculentum）、および落花生（A. Hypogaea）に由来する特定の DNA 標的など、複数の食物アレルゲン物質を、比色 LAMP 法により迅速に同時に検出できる可能性を検討しました。円形に配置されたマイクロ流体デバイス。加工食品中の7つのアレルゲンを同時に遺伝子検出するマイクロ流体診断装置を提供することを目的として、1列形式ではなく10個のマイクロチャンバーを円形にコンパクトに収納しました。図 7 に示すように、円形配置のデバイスでは、緑色の水 (0.1% w/v) を流速 30 µL/min ですべてのマイクロチャンバーに連続的に分注することに成功しました (ビデオ S4)。当社の液体連続分注法は、マイクロ流体デバイスの設計に大きな柔軟性をもたらし、これにより、排気マイクロチャネルによって形成される最外径20 mm内にコンパクトに収容された10個のマイクロチャンバを円形に配置する幾何学的設計が可能になります。このタイプのデバイスの幾何学的寸法は、L1 = 1.52 mm、L2 = 0.80 mm、および L3 = 0.89 mm として設計されました。 10 個のマイクロチャンバーに水を分注する理論上の最大許容流量は 160 μL/分未満と推定され、ギャップ距離はバルブ S1 および S2 でそれぞれ g1 = 40.5 μm および g2 = 21.4 μm、背面のコーナー半径は凸状構造の端は r1 = r2 = 6.4 μm、マイクロチャネルの幅と高さはそれぞれ W = 202.1 μm と H = 59.0 μm でした。

10 個の反応マイクロチャンバー (各約 3 µL) が円形に配置され、排気マイクロチャネルによって形成される最外径 20 mm 内にコンパクトに収納された、最適に設計された PDMS マイクロ流体デバイス。食物アレルゲンの多重遺伝子検出に使用されます。すべてのマイクロチャンバーを、流速 30 μL/min で緑色の水で順番に満たしました。

図８ａは、マイクロ流体デバイスを用いた比色ＬＡＭＰ法による小麦特異的ＤＮＡ（総ＤＮＡ濃度：１．０ｎｇ／μＬ）の検出の実験結果を示す。 LAMP 試薬と混合した小麦 DNA サンプルを装置に導入した後、60 °C の温水浴中で 60 分間 LAMP アッセイを実施しました。予想どおり、LAMP 反応溶液中の HNB (150 μM) の紫色から空色への色の変化によって示される陽性反応が、チャンバー 2、5、7、10 で、偽陽性や偽陰性なしに明確に観察されました。結果。ソバ DNA とピーナツ DNA を使用した LAMP アッセイでは、それぞれチャンバー 3 と 8 (補足図 S4a)、チャンバー 4 と 9 (図 S4b)、および陽性対照として使用されたチャンバー 5 と 10 で真陽性の結果が得られました。

スマートフォンのカメラで撮影した写真。(a) 小麦 DNA (No. 2 と 7)、(b) 小麦とそばの DNA の混合物 (No. 3 と 8)、(c) 小麦の混合物、ソバ、ピーナッツ DNA (No. 4 および 9)、および (d) 陰性対照として茶植物 DNA (60 °C で 60 分間実行される LAMP アッセイによる)。すべての植物種を識別するためのユニバーサルプライマーセットをポジティブコントロールとしてチャンバー No. 5 および 10 にプレスポットしましたが、ネガティブコントロールとしてチャンバー No. 1 および 6 にはプライマーをプリスポットしませんでした。

図 8b は、LAMP アッセイによる小麦 DNA とそば DNA の混合物（総 DNA 濃度：それぞれ 1.0 ng/μL）中の複数の食物アレルゲンの同時検出を示しています。陽性反応はチャンバー 2、3、5、7、8、10 で発生しましたが、二次汚染はありませんでした。 DNAサンプルの他の組み合わせ、つまり小麦DNAとピーナッツDNAの混合物（図S4c）およびソバDNAとピーナッツDNA（図S4d）を使用した多重LAMPアッセイでも、真の検査結果が得られました。同様に、3 つすべての DNA サンプルの混合物 (各 1.0 ng/μL) は、陰性対照として使用したチャンバー 1 と 6 を除くすべてのチャンバーで陽性反応を示しました (図 8c)。対照的に、茶の木から抽出した DNA (1.0 ng/μL) をデバイスに導入すると、陽性対照チャンバー (No. 5 および 10) でのみ紫色から空色への色の変化が観察され、偽陽性は見られませんでした。他のチャンバーでの反応（図8d）。

図9は、図8に示されたLAMP結果からCIELAB空間のa*-b*彩度平面にプロットされた色差の分布を示しています（同様に、図S4に示されたデータは補足図S5にプロットされています）。その結果、3 つの食物アレルゲンと陰性対照として使用した茶木の任意の組み合わせについて、LAMP アッセイを 60 分間実行した後、陽性グループと陰性グループの色が明確に分離されたことが明らかになりました。

陽性 (空色) と陰性 (紫) の LAMP 反応の色分布 (図 8 を参照) は、3 つの食物アレルゲン (小麦、そば、落花生) と陰性対照としての茶木の検出のために実行され、a にプロットされています。 *-b* CIELAB 色空間の有彩面。 LAMP 反応は 60 °C で 60 分間実行されました。

迅速かつ使いやすい多重遺伝子診断に使用されるPDMSベースのマイクロ流体デバイスの性能を向上させることを目的として、我々はエアプラグインバルブと呼ばれる新たに設計されたバルブ構成を提案しました。対向するバルブ間のエアトラップが完了すると、エアプラグインバルブの耐圧性能が大幅に向上しました。従来の両面ストップバルブを使用していたバルブ配置を、常設ストップバルブとして使用していたエアプラグインバルブに置き換えることにより、最大許容流量が最大14倍（約70μL/min）と大幅に増加しました。液体を分注して、10 個の反応マイクロチャンバーのアレイを満たす。さらに、空気プラグインバルブを導入することにより、分注可能なマイクロチャンバーの数に対する制限がなくなりました。我々は、作製したマイクロ流体デバイスにより、反応マイクロチャンバー間の相互汚染を引き起こすことなく、60℃で60分間実行する比色LAMPアッセイを1回の操作で行うことにより、3つの植物性食物アレルゲン（小麦、そば、落花生）を同時に検出できることを実証した。我々の連続液体分注法はマイクロ流体デバイスの設計に大幅な柔軟性を提供するため、診断デバイスは、円形に配置され、最外径20 mm以内にコンパクトに収容された10個の反応マイクロチャンバーの幾何学的構成で設計できることに注意する必要があります。

今後の研究では、操作手順を簡素化するために、マイクロ流体デバイスにLAMP試薬を事前に保存する方法だけでなく、遠心ポンプとキャピラリーバルブを組み合わせたポンプレスマイクロ流体デバイスの開発もさらに進めます。外部ポンプシステム (つまり、シリンジまたは圧力ポンプ) の場合。最終目標は、日本の法律で表示が義務付けられている 7 つのアレルギー誘発成分 (小麦、そば、落花生、卵、牛乳、エビ) だけでなく、すべてを同時に検出できる、迅速かつ簡単なサンプルツーアンサー診断プラットフォームを開発することです。、カニだけでなく、当社のマイクロ流体デバイスを使用して食中毒病原体（サルモネラ・エンテリカ、黄色ブドウ球菌、カンピロバクター・ジェジュニ、大腸菌O157:H7など）も検出し、食の安全と安心を確保します。原理的には、対象となる核酸標的 (DNA/RNA) の種類を柔軟にカスタマイズすることが可能です。したがって、この汎用性の高い技術は、アレルゲンだけでなく、さまざまな病原体（ウイルス、細菌、真菌、寄生虫）、有毒植物、違法薬物などによる感染症の現場での多重遺伝子検出にも、装置なしで適用できます。面倒な複数の操作が必要になる。

研究に関連するすべてのデータは記事に含まれるか、補足情報としてアップロードされます。

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本研究は、科学技術振興機構（JST）の「目標駆動型研究開発による適応的かつシームレスな技術移転プログラム（A-STEP）」（助成番号JPMJTM20EG）および豊橋技術科学大学の革新的研究連携事業の一部を受けて行われました。、日本。著者らは、英語の編集について Editage (www.editage.com) に感謝します。

豊橋技術科学大学機械工学科（〒441-8580 愛知県豊橋市）

Daigo Natsuhara, Ryogo Saito, Koki Shirai, Shunya Okamoto, Moeto Nagai & Takayuki Shibata

城西大学薬学部（〒350-0295 埼玉県坂戸市）

Sae Misawa & Masashi Kitamura

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すべての著者が等しく原稿に貢献しました。 DN: 方法論、調査、執筆—原案作成、SM: 方法論、調査、RS: 方法論、調査、KS: 方法論、調査、SO: 執筆—レビューおよび編集、監督、MN: 執筆—レビューおよび編集、監督、 MK：執筆―査読・編集、監修、資金獲得、TS：構想化、執筆―査読・編集、監修、プロジェクト運営資金獲得。

Correspondence to Daigo Natsuhara or Takayuki Shibata.

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガーネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

補足ビデオ S1。

補足ビデオ S2。

補足ビデオ S3。

補足ビデオ S4。

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転載と許可

夏原大将、三澤晋、斉藤良他さまざまな食物アレルゲンを同時に遺伝子検出するための空気プラグインバルブを備えたマイクロ流体診断装置。 Sci Rep 12、12852 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-16945-2

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受信日: 2022 年 3 月 27 日

受理日: 2022 年 7 月 19 日

公開日: 2022 年 7 月 27 日

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